菌落总数与大肠菌群数测定

菌落总数与大肠菌群数测定主要内容菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）掌握菌落总数测定方法01实验原理不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36℃，48h（水产品30℃，72h），菌落数02菌落总数测定菌落总数测定器材与试剂：样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿”菌落总数测定倾注培养培养结果菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废实验步骤某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数计算方法菌落总数测定菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）所有稀释度均>300

取稀释倍数最大者（4）所有稀释度均<30

取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml（g）无菌操作标记何时更换吸管吸吹混匀琼脂培养基保温安全常识注意事项：菌落总数测定实验目的实验原理℃，48h，产气（小倒管）三步法：初发酵、复发酵器材与试剂样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管大肠菌群数测定初发酵器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球实验步骤：01初发酵02大肠菌群数测定吸取样品方法加注样品初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。实验步骤复发酵选取产气试管接种至10mlBGLB肉汤中培养：36℃，48h观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：

45℃，无菌，倾注，15ml

（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：36℃，48h分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环划下一个区前必须灭菌接种环划线时接种环同平板呈30-40°角每次划线应该压到上一个区域的2-3条线用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动操作要点分区划线法大肠菌群数测定实验步骤分离培养：菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深革兰染色、镜检：选特征菌落革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸1涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀2热固定：通过火焰若干次3初染：结晶紫一滴，1min，水洗6复染：复红一滴，30s5脱色：95%乙醇，30s或至无色为止4媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗革兰染色法涂片热固定初染媒染脱色复染革兰染色法革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性复发酵器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管实验步骤复发酵选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个接种至10ml乳糖蛋白胨培养液培养：37℃，24h观察指标：产酸，产气大肠菌群数测定液体接种复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生无菌操作吸管使用洗去染液的方法显微镜保养液体接种注意事项：大肠菌群数测定MPN法（MostProbableNumberMethod）01目的：对某种细菌进行选择性计数02核心思想：泊松分布03实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值04MPN法原理MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数2若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：其中C为常系数V为总水样量，x为细菌个数3MPN法原理当y(x)max，XMPN由于y(x