第二章-紫外-可见分光光度法

第二章紫外-可见分光光度法第一节概述第二节基本原理第三节紫外可见分光光度计第四节可见分光光度法第五节目视比色法第六节紫外分光光度法一、紫外-可见分光光度法分类

1、分光光度法分类

2、紫外-可见分光光度法二、紫外-可见分光光度法的特点第一节概述一、紫外-可见分光光度法分类

1、分光光度法分类(按所用的光的波谱区域不同)（1）可见分光光度法：400～780nm（2）紫外分光光度法：200～400nm（3）红外分光光度法：3×103～3×104nm2、紫外-可见分光光度法是基于物质分子对200～780nm区域内光辐射的吸收而建立起来的分析方法。二、紫外-可见分光光度法的特点

1、具有较高的灵敏度；（检测下限10－5～10－6M）2、操作简便，分析速度快；3、价格低廉，应用广泛。一、光的基本特性二、物质对光的选择性吸收三、吸收定律第二节基本原理一、光的基本特性1、电磁波谱光是一种电磁波，具有波粒二重性。光既是一种波，具有波长（

）；光也是一种粒子，又具有能量（E）。2、单色光和互补光

单色光：具有同一种波长的光。

复合光：含有多种波长的光。如：白光。互补光：如果把适当颜色的两种光按一定的强度比例混合，可成为白光，那么两种颜色的光称为互补光。

/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿二、物质对光的选择性吸收1、物质颜色的产生完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光结论：若某溶液选择性地吸收了可见光区某波长的光，则该溶液呈现出被吸收光的互补色光的颜色。例如：重铬酸钾溶液颜色是黄色的，溶液吸收了可见光中的蓝色；硫酸铜溶液颜色是蓝色的，溶液吸收了可见光中的黄色。2、物质的吸收光谱曲线（1）在进行吸光度测定时，通常选取在最大吸收波长处来测量。（2）不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线形状相似，最大波长不变，但吸收峰峰高随浓度的增加而增高。（定量分析）（3）不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。（定性分析）AB3、分子吸收光谱产生的机理分子中电子跃迁产生的电子光谱处于紫外和可见光区。电子跃迁的同时，伴随着振动能级和转动能级的跃迁；带状光谱。三、吸收定律1、朗伯-比尔定律入射光被溶液吸收的程度与溶液的厚度关系为：朗伯定律：当溶液浓度和入射光通量一定时，光吸收程度与溶液液层厚度成正比。ФtФ0bcФt/Ф0：表示溶液对光的透射程度，称为透射比τ。Lg(Ф0/Фt)：表示单色光通过溶液时被吸收的程度，称为吸光度A。入射光被溶液吸收的程度与溶液的厚度关系为：比尔定律：当溶液液层厚度和入射光通量一定时，光吸收程度与溶液浓度成正比。ФtФ0bc入射光被溶液吸收的程度与溶液的厚度关系为：朗伯-比尔定律：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。A=Kbc朗伯-比尔定律的适用条件：（1）必须使用单色光；（2）吸收发生在均匀的介质；（溶液为稀溶液）（3）吸收过程中，吸收物质互相不发生作用；（4）吸收定律对紫外光、可见光、红外光都适用。2、吸光系数K（1）摩尔吸光系数当溶液浓度c的单位为mol/L，用ε表示，其单位为L/mol·cm。（2）质量吸光系数当溶液浓度c的单位为g/L,用a表示，其单位为L/g·cm。其物理意义是：单位浓度的溶液液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度。K大小与入射波长、溶液温度和溶剂性质有关。3、吸光度的加和性在多组分的体系中，在某一波长下，如果各种对光有吸收的物质之间没有相互作用，则体系在该波长的总吸光度等于各组分吸光度的和。A总=A1+A2+…An=ΣAn4、影响吸收定律的主要因素（1）入射光为非单色光引起偏离（2）溶液的化学因素引起偏离（3）比尔定律的局限性引起偏离AC比尔定律只适用于浓度小于0.01mol•L－1的稀溶液。一、仪器的基本组成部件二、紫外-可见分光光度计的类型及特点三、常用紫外-可见分光光度计的使用

第三节紫外可见分光光度计光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统一、仪器的基本组成部件光源单色器吸收池光电管暗盒光电倍增管放大器微安表单色器1、光源作用：供给符合要求的入射光。（1）可见光光源常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。（2）紫外光光源常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳压器。2、单色器作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光，它是分光光度计的心脏部分。组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光栅）、透镜系统组成。（1）棱镜单色器玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。（2）光栅单色器可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外-可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。3、吸收池（比色皿）作用：用于盛放待测液和决定透光液层厚度的器件。吸收池的规格是以光程为标志。玻璃吸收池：只能用于可见光光区测定石英吸收池：用于紫外光区测定，也可以用于可见光光区测定。分类：使用吸收池过程，应特别注意保护两个光面：（1）拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面；（2）不能将光学面与硬物或赃物接触，只能用擦镜纸或丝绸擦拭光学面；（3）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长时间盛放在吸收池；（4）吸收池使用后应立即用水冲洗干净；（5）不得在火焰或电炉上进行加热或烘烤吸收池。4、检测器（接受器）作用：对透过吸收池的光做出响应，并把它转变成电信号输出，其信号大小与透过光的强度成正比。常用的检测器：光电池、光电管和光电倍增管。作用：由检测器产生的电信号，经放大等处理后，用一定方式显示出来，以便于计算和记录。常用的信号显示器：（1）指示仪表（检流计或微安表），（2）数字显示和自动记录型装置。5、信号显示器二、紫外-可见分光光度计的类型及特点1、按使用的波长范围分可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm，只能用于测量有色溶液的吸光度紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收的物质的吸光度。

2、按光路分单光束分光光度计是指从光源发出的光，经过单色器等一系列光学元件及吸收池后，最后照在检测器上始终为一束光。双光束分光光度计是指从光源发出的光，经过单色器后被切光器分为强度相等的两束光，分别通过参比溶液和样品溶液，利用切光器使两束光交替地照在同一检测器上。（1）单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池比色皿检测器信号显示系统（2）单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器三、常用紫外-可见分光光度计的使用

1、721型可见分光光度计——单光束http:///vlabcq/flash/分光光度计/分光光度计.html可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm，只能用于测量有色溶液的吸光度紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收的物质的吸光度。

2、紫外-可见分光光度计——双光束http:///vlabcq/flash/分光光度计/分光光度计.html可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm，只能用于测量有色溶液的吸光度紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收的物质的吸光度。四、分光光度计的维护

1、仪器对工作环境的要求稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、光线不宜过强（1）电源稳定在220V，最好配备稳压器；（2）光源不用不要开；（3）单色器不能拆开，经常更换干燥剂；（4）正确使用吸收池；（5）光电转换元件不能长时间曝光。

2、仪器保养和维护方法一、显色反应和显色剂二、显色条件的选择三、测量条件的选择四、定量方法

第四节可见分光光度法一、显色反应和显色剂

1、显色反应：将待测组分转变成有色化合物的反应。显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂。

2、类型氧化还原反应Fe3＋＋e=Fe2＋配位反应Fe3＋＋5SCN－=Fe(SCN)52－（1）选择性要好。（2）灵敏度要高。（3）有色化合物的组成要恒定，化学性质稳定。（4）显色剂的颜色与有色化合物的颜色差别要大。（5）显色条件要易于控制。3、选择显色反应的标准二、显色条件的选择（一）显色剂用量M为被测物质，R为显色剂，MR为反应生成的有色配合物，其反应式为：M＋R≒MR显色剂一般应适当过量。实验的方法为：固定被测组分的浓度和其它条件，然后加入不同量的显色剂，分别测定吸光度A值，绘制吸光度（A）-显色剂浓度（cR）曲线。（二）溶液酸度1、当酸度不同时，会生成配位比不同的配合物，其颜色也有所不同。如：Fe3+与水杨酸的配合物：PH＜4 Fe(C7H4O3)+

紫色4＜PH＜9 Fe(C7H4O3)2－ 红色PH＞9 Fe(C7H4O3)

33－黄色2、酸度过高会降低配合物的稳定性；酸度较低时，不利于显色反应的进行。3、酸度变化，显色剂的颜色可能发生变化。如：用二甲酚橙为显色剂，它与金属离子形成的配合物为红色，它本身在PH<6.3时为柠檬黄色，而在PH＞6.3时为红紫色。所以在PH＞6.3时，就无法进行测定。实验方法：固定待测液组分与显色剂浓度，改变溶液pH，分别测定吸光度A值，绘制A-pH关系曲线。选择曲线平坦部分对应pH作为应控制的pH范围。（三）显色温度

一般显色反应在室温下进行，但是也有一些反应要加热到一定温度下才能进行。

适宜的显色温度要由实验来确定。（四）显色时间显色时间：反应完成所需要的时间；稳定时间：显色后有色物质色泽保持稳定的时间。适宜的显色时间要由实验来确定。实验方法：配制一份显色溶液，从加入显色剂开始，每隔一定时间测定吸光度A值，绘制A-t关系曲线。选择曲线平坦部分对应时间作为应控制的时间范围。（五）溶剂的选择有色化合物在有机溶剂中稳定性好，溶解度大。三、测量条件的选择（一）入射光波长的选择依据被测物质的吸收曲线，选用最大吸收波长作为入射波长。

根据“吸收最大干扰最小”的原则。1、溶剂参比如果仅有显色剂与被测组分反应的产物有吸收，则可以用溶剂作参比溶液。2、试剂参比如果显色剂和其他试剂有颜色，则用试剂溶液作参比液。3、试液参比如果试液中其他共存组分有吸收，则用试液作参比液。4、褪色参比（二）参比溶液的选择测量吸光度过高或过低，误差都很大，一般适宜的吸光度范围是0.2～0.8。

控制的方法为：1）调节溶液的浓度；2）选用适当厚度的比色皿。（三）吸光度测量范围的选择四、定量方法1、工作曲线法（标准曲线法）（1）作图法方法：配制一系列不同含量的待测组分的标准溶液，以不含待测组分的空白溶液为参比，测定标准溶液的吸光度。并绘制吸光度—浓度曲线，得到标准曲线（工作曲线），然后再在相同条件下测定试样溶液的吸光度。由测得的吸光度在曲线上查得试样溶液中待测组分的浓度，最后计算得到试样中待测组分的含量。（2）计算法工作曲线可用一元线性方程表示：y=a＋bxb为直线斜率a为直线的截距r为相关系数2、比较法用一个已知浓度的标准溶液cs，在一定条件下，测得其吸光度As，然后在相同条件下测得试液cx的吸光度Ax：条件：cs与cx浓度应接近，且符合吸收定律。一、方法原理二、测定方法三、特点目视比色法：用眼睛观察比较溶液颜色深浅，来确定物质含量的分析方法。第五节目视比色法一、方法原理将有色的标准溶液和被测溶液在相同条件下对颜色进行比较，当溶液液层厚度相同、颜色深度一样时，两者的浓度相等。据吸收定律：

由于εs=εx，当bs=bx，As=Ax时，则cs=cx。二、测定方法（标准系列法）系列标准溶液的配制：取一套完全相同的比色皿，依次加入不同量的待测组分标准溶液和一定量的显色剂及其他辅助试剂，并用蒸馏水或其他溶液稀释到同样体积，配成1套颜色逐渐加深的标准色阶。待测试液的配制：取一定量的待测试液在同样条件下显色。观察：从管口垂直向下观察。三、特点优点：仪器简单、操作方便、适宜大批样品的分析、灵敏度高，可分析混浊溶液。缺点：主观误差大、准确度差。一、方法原理（一）有机化合物紫外吸收光谱的产生（二）紫外吸收光谱常用术语二、紫外分光光度法的应用（一）定性鉴定（二）定量分析

第六节紫外分光光度法一、方法原理（一）有机化合物紫外吸收光谱的产生有机化合物的紫外-可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果：σ电子、π电子、n电子。分子轨道理论：成键轨道—反键轨道。sp

*s*RKE,Bnp

ECOHnpsH电子跃迁类型（常见）

（1）σ→σ*跃迁指处于成键轨道上的σ电子吸收光子后被激发跃迁到σ*反键轨道。（2）n→σ*跃迁指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向σ*反键轨道的跃迁（3）π→π*跃迁指不饱和键中的π电子吸收光波能量后跃迁到π*反键轨道。（4）n→π*跃迁指分子中处于非键轨道上的n电子吸收能量后向π*反键轨道的跃迁。电子跃迁类型不同，实际跃迁需要的能量不同，

σ→σ*～150nmn→σ*

～200nmπ→π*～200nmn→π*～300nm吸收能量的次序为：

σ→σ*＞n→σ*≥π→π*＞n→π*sp

*s*RKE,Bnp

E电子跃迁所处的波长范围1、生色团和助色团生色团：在200～1000nm波长范围内产生特征吸收带的具有一个或多个不饱和键和未共用电子对的基团。如：C＝C＝、C＝O、亚硝基、偶氮基—N＝N—、腈基—C≡N、C≡C等。助色团：一些含有未共用电子对的氧原子、氮原子或卤素原子的基团。如：—F，—CH3，—Br，—OH等。（二）紫外吸收光谱常用术语2、红移与蓝移由于取代基或溶剂的影响造成有机化合物结构的变化，使吸收峰向长波方向移动的现象，称为吸收峰红移。由于取代基或溶剂的影响造成有机化合物结构的变化，使吸收峰向短波方向移动的现象，称为吸收峰蓝移。3、增色效应和减色效应由于有机化合物的结构变化，使吸收峰摩尔吸光系数增加的现象称为增色效应。由于有机化合物的结构变化，使吸收峰摩尔吸光系数减小的现象称为增色效应。由于溶剂的极性不同，引起某些化合物的吸收峰的波长、强度及形状产生变化。4、溶剂效应1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮非极性→

极性n

→

*跃迁：兰移；；

→*跃迁：红移；；极性溶剂使精细结构消失5、吸收带类型（1）R-带（取自