《烟草废弃物中芦丁提取工艺的实验探究》10000字（论文）

烟草废弃物中芦丁提取工艺的实验研究 8312摘要 摘要：烟草主要以工业原料的形式用于中国的卷烟生产。但是在中国烟草措施日益严格的情况下，制约着烟草种植发展。所以，把烟草向食品及保健品，医药，饮料，化妆品等产业开发，有利于烟草种植业不断向前发展。另外，每年烟草采收后产生的几十万吨废弃物不能够应用到卷烟生产中去，同时这些废弃物也得不到合理利用和有效处理，不仅浪费可用资源，而且污染环境。因此，如何有效回收和利用废弃烟草，是烟草业急需解决的难题之一。其中，综合利用烟草中含有的天然活性成分芦丁以提高其利用率具有重要意义。同时，也可降低烟叶生产成本。实现经济效益最大化。因此开发烟草综合利用途径十分必要。迫在眉睫。势在必行。刻不容缓。任重而道远。当务之急。刻不容缓。本论文运用现代提取分离技术理论与方法对烟草废料有效部位芦丁进行分离提取工艺研究，建立并改进了适合上述有效成分的最佳提取分离工艺。本项目以烟草废料为研究对象，综合国内外所进行的有关研究，运用现代提取分离技术的理论与方法对烟草废料有效成分芦丁进行了分离与提取技术研究，建立并完善了适用于上述活性成分提取分离的优化工艺。另外，本论文还通过对国内外文献进行调研，对烟草废弃物若干活性成分进行提取优化，摸索出一套联合提取与分步分离相结合的生产工艺流程，以期对烟草废弃物综合利用有新的思路，并发现可能具有更高价值的活性成分。关键词：烟草废弃物，芦丁，提取分离工艺前言天然产物是由动物，植物，微生物，海洋生物等分离得到的代谢产物，这类有机化合物来到自然界一般都有其特定的生理活性，或者可以作为先导化合物经过合适的结构改造后转化为下一代药物。有些天然产品还有很大经济价值，例如用作食品添加剂，日化原料等化工产品。天然产物提取方法很多。本文综述了目前应用较多的几种植物提取物制备工艺及其在食品中的作用机理。并对其发展趋势作了展望。溶剂法：是最常用的一种提取方法。它包括回流和萃取两种。有效成分的萃取和分离应根据其主要物理，化学性质和各种萃取技术的原理，特性进行筛选，才能确保所要求组分的呈现，同时尽可能地避免不必要组分的扰动，使随后的分离工作得以简化。提取方法分为传统提取方法与现代提取方法两大类。常规萃取技术有溶剂萃取，蒸汽蒸馏，升华等。溶剂萃取法是以“相似溶解”原理为依据。提取方法有浸泡法，渗滤法，煎煮法，回流提取法，连续回流提取法等。蒸汽蒸馏的基本原理就是加热煮沸时，被分离出来的物质会随着蒸汽一起被带走。升华法是物质受热后直接变成气体然后凝结为固体。这些提取方法无需专用仪器设备，过程简单费用低。传统的分离纯化天然活性成分的方法包括溶剂萃取法、沉淀分离结晶法和色谱法。近年来，随着人们环保意识的提高和国家可持续发展战略的提出，天然产物的分离纯化技术有了长足的进步。新兴技术包括新型色谱技术、大孔树脂吸附技术、膜分离技术以及分子蒸馏技术等。其中，新型色谱技术主要有：高通量固相-液相色谱仪（HPLC），毛细管电泳仪（CE），凝胶过滤色谱法（GPC）及快速质谱联用分析系统，这些新技术具有传统方法无法比拟的优势，对提高生产效率、减少环境污染起到了积极的促进作用。烟草这一特殊经济作物，其种植过程中产生的副产物根茎芽顶部大约占烟草产量的一半多没有得到有效处理与合理利用，年产生几十万吨左右的烟叶，烟末及其他废弃物无法应用于卷烟生产中，给可利用资源带来很大浪费。烟草废料的综合利用研究受到了广泛关注。国内外相关研究数据表明，废烟草的综合利用包括焚烧、排放加热、发酵生产有机肥和乙醇、生产烟片、活性炭和提取重要化合物。烟草重要化合物提取与利用的研究重点是重要医药原料茄尼醇与尼古丁，营养价值高的蛋白质和药理和生物活性较广的活性物质有绿原酸等。作为重要资源受到广泛关注，烟叶为全球主要经济作物之一。在我国烤烟产量占粮食总产量的1/3.随着人民生活水平的不断提高。对优质烟用原料的需求与日俱增。因此，烟草加工十分迫切，前景广阔，潜力巨大。但烟草废料中存在着某些具有高附加值的潜在活性成分。近些年来，烟草工业得到大力发展，烟草废料中活性成分分析探讨及其分离纯化工艺研究也逐渐受到研究者重视。对于烟草及废弃物中活性成分开展更加广泛和深入地研究，推动烟草行业向多元化方向发展，发挥出其较高经济价值与社会效益。切实提高烟草废弃物综合利用效率并开发其潜在价值显得尤为重要。本研究通过对比试验，建立了烟草废料中芦丁的快速检测方法。通过单因素分析法考察提取次数，乙醇浓度，液料比，提取温度，超声波提取时间5个因素对芦丁提取率影响。通过比较不同种类大孔树脂的吸附和解吸性能，筛选出适合于烟草废料提取物中芦丁富集的树脂，并讨论了树脂柱层析动态富集芦丁的技术条件。对优化条件进行了验证实验，同时对烟草废弃物及提取物中芦丁纯度进行了检测，检验了优化工艺对其影响。1实验部分芦丁，别名芸香苷，是一种含多羟基、具有抗菌、抗氧化、抗炎等广泛药理活性、细胞毒性低乃至无毒的天然抗氧化剂，近年来受到国内外学者广泛关注。主要用于治疗高血压、心血管、胃病、皮肤病、糖尿病等疾病。现已广泛应用于医药、保健食品和化妆品工业。目前烟草废弃物中主要有效成分大多是烟碱、茄尼醇、蛋白质等。但黄酮类化合物特别是芦丁却鲜见报道，烟草中芦丁含量已达到0.45%-1.5%。虽然有部分提取溶剂对烟叶中芦丁的提取率进行了比较分析，认为乙醇是较好的提取剂，但还未见到对其他条件（如提取温度、时间、液料比等）进行优化提取的有关报道。所以该研究选择废弃烟叶作为研究对象，用准乙醇水溶液作提取剂，采用超声波辅助提取法从废烟草中提取芦丁，粗提物经大孔树脂分离富集。通过比较不同树脂对废弃烟叶提取物中芦丁静态吸附解吸的效果，筛选出富集分离烟叶芦丁较为理想的树脂，并在此基础上对树脂工艺参数进行考察与优化，以期为烟草中芦丁提取与分离的研究提供借鉴。1.1仪器与试剂（1）植物材料烟草品种K326栽培于广东南雄市湖口镇。调制后在烟草收购站没有收购到的低等级烟叶，作为烟草废料研究的材料。（2）试剂本研究中所使用之芦丁标准品（纯度>99%）及三氯化铝（A.R.级）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。盐酸，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，氯化钠，醋酸钠，冰醋酸和乙醇是从广州化学试剂厂购买的分析纯（A.R.）级。（3）仪器设备微孔分光光度仪（贝生仪器有限公司），真空吸泵（巩义市映宇玉华仪器厂）、移液枪（大隆兴创实验仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发器（上海青浦湖西仪器厂）、BB25—12DT型微孔分光光光度仪（美国伯腾仪器有限公司）、BB26—12DT—20型伯腾玻璃分析仪、BB—20型牛蜀玻璃分析仪、B25—20型玻璃分析仪、B24—20型玻璃柱、MSA524S—1型旋转蒸发仪。1.2实验方法1.2.1分光光度计快速测定芦丁含量的方法的建立在国家标准中，烟草芦丁是用高效液相色谱法精确检测的。该方法准确、稳定，但分析时间至少需要40min，费时、费力、昂贵，不利于大批量样品的检测。然而，芦丁是烟叶中的主要黄酮类化合物。为了方便快捷地检测提取物中芦丁的含量，参考槐花等植物组织提取物中芦丁的检测方法，比较了三种分光光度法检测烟叶提取物中芦丁的含量。具体步骤简单介绍如下：（1）芦丁对照品溶液制备准确称取120℃干燥的芦丁标准样品0.0105g，溶于60%乙醇中，摇匀，稀释至100mL，制成浓度为0.10mg/ml-1的芦丁标准样品，储存于4℃冰箱中备用。（2）样品溶液制备精确称取干烟叶粉末1.0克178～840m,放入干净50ml锥形瓶内，加乙醇30ml,以乙醇为萃取溶剂，放入超声波清洗器超声萃取20min,50℃萃取3次，合并滤液过滤得样品溶液。（3）三氯化铝显色法并且对文献（赵恩泽2011）的实践进行借鉴与完善。具体步骤略述如下。画标准曲线：精确汲取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL芦丁标准件，编号0.1，2，3，4，5，将其置于6个干净的10mL容量瓶中，加入1ml0.1molL三氯化铝和1.5ml0.2molL的醋酸钠-醋酸盐缓冲液,pH=5.5，以吸光度为横坐标，浓度（mg.ml-1）为纵坐标绘制标准曲线为对照。试样中芦丁含量测定：吸取约1.4mL样品于5mL离心管中，加入1mL石油醚萃取至上清液无色，取出滤液1mL于干净的10mL容量瓶中，根据标准曲线画出吸光值代入标准曲线算出芦丁提取率。（4）硝酸铝显色法现将参考方法（马国刚，2007）及具体步骤略述于下。画出标准曲线：将0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL将芦丁准确吸取到6个干净的10mL容量瓶中，得到0,1,2,3,4,5芦丁的标准样品。加入0.5mL亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min。然后加入硝酸铝溶液1ml,摇匀，静置6min。以吸光度为横坐标、浓度（mg·ml-1）为纵坐标绘制标准曲线。样品中芦丁的检测：取约1.4mL样品于5mL离心管中，加1mL石油醚提取无色上清液，取滤液1mL置于洁净的10mL容量瓶中，测其吸光度值，代入标准曲线算出芦丁提取率。（5）紫外分光光度法参考文献（刘玉芬等，2005）的方法，具体操作步骤简单描述如下。画出标准曲线：将0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mL芦丁精确汲取到6只干净10mL容量瓶内，编号0-1-2-3-4-5，以10mL芦丁乙醇进行定容。以0为空白对照测定No的吸光度。波长260nm0-5标准样本。以吸光度为横坐标，浓度（mg.ml-1）为纵坐标绘制了标准曲线。试样中芦丁含量测定：取1.4mL试样在5mL离心管内，加1mL石油醚提取至上清液呈无色时，取滤液1mL在洁净10mL容量瓶内，测定吸光值并代入标准曲线算得芦丁提取率。1.2.2超声波辅助提取废弃烟叶芦丁的工艺优化（1）实验流程先将废烟叶收集起来，然后采用超声波辅助乙醇提取废烟叶中的芦丁。利用单因素分析获得最佳提取参数是提取次数、提取温度、超声作用时间、提取液乙醇浓度及液料比、芦丁产量为响应值进行响应面分析获得随机变量相互作用及最优组合及响应目标最优值。实验设计过程见图1-1。图1-1实验设计流程图（2）原料预处理45℃干燥，粉碎，筛分，回收178-840μM烟草粉，储存在干燥器中备用。原料预处理工艺见图2-2：图1-2原料预处理流程图（3）提取工艺流程精确称取一定数量的预处理烟叶粉并将其放置于洁净50mL锥形瓶内，加入一定量的提取溶剂，放入超声波清洗机中，在特定温度下提取，超声一段时间后提取一定量，滤除合并滤液即得样品溶液。提取工艺流程如图1-3所示：图1-3废弃烟叶中芦丁提取工艺流程图（4）单因素试验精确称取1.0克预处理废烟叶粉作提取液，芦丁提取率为评价指标。研究提取次数，提取液乙醇浓度，液料比，提取温度，超声时间等五个单因素对于芦丁提取速率的影响。1.2.3大孔树脂型号的筛选（1）上样液的制备根据上述方法获得制备提取物的最佳工艺，并在70℃真空减压下浓缩至约原体积的1/10，保存起来待用，用时加入适量去离子水进行稀释即可。（2）静态吸附性能的测定将1.0g前处理的3种大孔吸附树脂分别精密称取装在60mL具塞广口瓶内，添加取上样液20mL,另将未添加树脂的具塞广口瓶加到20mL,放入摇床内，在80r.min-1,25℃振荡12h,将吸附液滤过，滤液分别按三氯化铝显色法测定芦丁的吸附量和吸附率。式中C0为上样液中芦丁的浓度C1为吸附后滤液中芦丁的浓度V1为上样液体积N为稀释倍数1.2.4D101树脂柱层析法分离废弃烟叶中芦丁工艺条件的研究影响同种大孔树脂对目标物质吸附作用的主要因素包括被分离化合物性质、样品溶液清晰度、样品溶液中目标物质浓度以及样品流速等。影响大孔树脂与目标物质解吸的主要因素有洗脱剂的选择、洗脱液浓度和洗脱流速。本试验采用废烟叶提取物水溶液作试样，乙醇作洗脱剂。对样品中芦丁的浓度，进样流速，洗脱液乙醇浓度、洗脱流速等因素对废烟叶中芦丁在D101树脂上分离富集的影响规律，并优选了D101树脂柱进行芦丁分离的最佳条件。（1）湿法装柱在φ20×400玻璃层析柱上装上预处理大孔树脂。首先往玻璃层析柱内加水10cm,再把浸没在水中的树脂搅拌均匀后沿玻璃棒慢慢倒进层析柱内，打开玻璃层析柱活塞并调整流速使水由下向上慢慢排出，待树脂自然下沉后不留下气泡，装柱时需要时刻保持液面一直高于树脂层。待大孔树脂充分析出时，以蒸馏水冲洗至均衡，有效柱高度为10cm，保持柱面光滑备用。（2）D101树脂的预处理与再生先在大孔树脂中加入0.5倍树脂体积的大体积乙醇，浸泡24h后吸附膨胀完全。用2BV（体积为2倍柱）乙醇，以2BV·h-1的流速清洗树脂层，直至流出液不洁白，混浊为止。用同样流速清水漂洗至流出物无乙醇味为止。采用2BV5%HCL溶液在自然流速下透过树脂层浸泡4h,再用清水漂洗至流出液中性。再在自然流速下将2BV5%NaOH溶液在树脂层中浸泡4h后水洗至流出液中性。（3）上样液浓度对吸附效果的影响分别制备芦丁浓度在1mg.mL-1,2mg.mL-1,3mg.mL-1,4mg.mL-1上样液。准确称取1.0g预处理过的D101树脂，放入60mL塞子瓶中，使加载样品中芦丁的总含量均匀。加入不同浓度的加载溶液，放入振动台。在80r·min-1和25℃下摇晃2h，然后取出吸附液并过滤。按所述方法测试芦丁浓度并计算吸附量。（4）洗脱液中乙醇浓度对解吸效果的影响制备不同乙醇浓度的解吸溶液(解吸溶液，解吸溶液，准确称1.0g饱和D101树脂，置于60mL的瓶塞中，加不同乙醇配比解吸液20mL,放入摇瓶内，在25℃下摇2h,80r·min-1，滤去解吸液并按检测解吸液芦丁的浓度。（5）上样流速度及体积的确定按上述方法装柱，上样芦丁浓度为2mg·ml-1的样品溶液，控制流速为1ml·min-1、2ml·min-1、3ml·min-1、4ml·min-1通过大孔树脂柱。逐级收集流出液(5mL/管)，检测每管中芦丁的浓度。当芦丁在废水中的溶解度达到加载溶液的10%，即0.2mg·ml-1时，以泄漏点为加载终点计算加载体积。以管数为横坐标，动态吸附浓度为纵坐标，画出各流量的采样曲线。式中C3为流出液中芦丁的浓度（6）洗脱流速及洗脱体积的确定将以上饱和树脂用高乙醇浓度解吸溶液洗脱后分别以1mL·min-1、2mL·min-1、3mL·min-1和4mL·min-1的速度控制它们向大孔树脂柱内流动。逐级采集流出液（5mL/管），并对各管道溶液中芦丁浓度进行测试。将流出液芦丁浓度达2mg.mL-1作为终点，统计达到洗脱终点后所得流出液体积作为动态解吸液的量。以管号作为横坐标、流出液芦丁浓度作为纵坐标，画出了各个流量下洗脱曲线。2结果与讨论2.1三种测定方法对比结果按照上述方法获得了三氯化铝比色法、硝酸铝比色法和紫外分光光度法测定芦丁含量的标准曲线。相关系数如图2-1所示。三种测定方法的标准曲线均可用于待测样品中芦丁的分析。图2-1标准曲线图A用三氯化铝显颜色，B用硝酸铝显颜色，C采用紫外分光光度法。将拟定的三条标准曲线应用于同一样品中芦丁的含量检测，反复检测3次，数据如表2～表1所示。3种方法所测相同样品中芦丁含量存在明显差异。紫外分光光度法测得芦丁的含量最多，达到84.1303mg.g-1，其次是硝酸铝显色法，为55.0789mg·g-1,三氯化铝法测得的芦丁的含量比较低，达19.2086mg.L-1。紫外分光光度法复测相同样品中芦丁的极差及相对标准偏差均为3种方法之首，且相对标准偏差＞2%，说明此方法比较对稳定性较差，不宜应用于烟叶中芦丁含量测定。硝酸铝比色法的结果比氯化铝比色法高约3倍，这与周春华(2005)提出的结论一致。因此，硝酸铝显色法不适用于烟草中芦丁的测定。而三氯化铝显色法特异性强，最接近文献中国标HPLC法的检测结果。因此，三氯化铝显色法更适合烟叶提取液中芦丁的快速检测。表2-1三种方法测定芦丁含量结果的对比测定方法三氯化铝法硝酸铝法紫外分光光度法吸光值平均值0.39480.26200.5782吸光值极差0.00750.00620.0441芦丁浓度/mg·mL-10.02130.03060.0467含量/mg19.208655.078984.1303相对标准偏差/%1.02041.21243.93482.2单因素分析结果（1）提取次数对芦丁得率的影响固定液料比30mL.g-1、提取温度50℃、超声波作用时间10min、乙醇浓度60%左右。摘要考察不同超声波作用时间（1,2,3,4）对废烟叶芦丁提取速率的影响。结果见图2-2，芦丁得率随超声次数增加呈现先逐渐升高而后又稍有降低的趋势，且萃取3次得率最高。因此，提取次数以三次比较合适。图2-2提取次数对芦丁得率的影响（2）液料比对芦丁得率的影响固定提取温度50℃、超声时间20min、超声三次、乙醇浓度60%,考察不同液料比（10、20、30、40、50mL·g-1）对废弃烟叶芦丁提得到率的影响。研究表明，液料比在30mL·g-1和40mL·g-1时，提取得率较高，如图2～3所示，但是鉴于提取溶剂量的增加会对后续过程带来一定的难度，因此选用液料比为30mL.g-1是比较适宜的。图2-3液料比对芦丁得率的影响（3）超声时间对芦丁得率的影响固定液料比30ml·g-1，提取温度50℃，超声波提取3次，乙醇浓度60%。研究了不同超声时间(6、9、12、15、18min/次)对废烟叶中芦丁提取率的影响。当超声时间为6~15min/次时，芦丁的提取率有增加的趋势(图2-4)，随后随着超声时间的延长，提取率略有下降。因此，每15分钟超声一次，效果更佳。图2-4超声时间对芦丁得率的影响（4）提取温度对芦丁得率的影响固液比为30ml·g-1、超声时间为15min、超声次数为3、乙醇浓度为1时。考察不同提取温度（35,45,55,65,75℃）对废烟叶芦丁提取率影响规律。由图2-5可得萃取率随萃取温度提高而提高，55℃附近提取得率最高，55℃以上得率降低。图2-5提取温度对芦丁得率的影响（5）提取物中乙醇浓度对芦丁产量的影响液料比30ml.g-1，提取温度50℃,超声时间15min,超声次数3次。研究了不同乙醇浓度对废烟叶中芦丁萃取率的影响。从图2-6可以看出乙醇浓度20%-40%对芦丁的提取率增加，乙醇浓度大于40%芦丁则逐渐降低。乙醇浓度40%时产率越高。图2-6乙醇浓度对芦丁得率的影响2.3筛选大孔树脂的结果按前面介绍的方法进行了六次反复试验，并对平均吸附量，吸附率，解吸量及解吸率进行了计算，其结果见表2～6。在上样量约10mg时,D101吸附量达到最大值9.57mg,S-8吸附量9.37mg稍低,D101和AB-8吸附量均达到最小值8.47mg。吸附率的大小依次是D101＞S－8＞AB－8。添加解吸液解析大孔树脂测得D101,S-8,AB-8的解吸量分别是8.69mg,6.03mg,7.66mg,解吸率的大小依次是:D101＞AB-8＞S-8。尽管S-8的吸附率最高，但是3种树脂吸附量很差只有约1mg,且相差不大。然而，在解决率方面存在很大差距。D101的分辨率为94.7%，AB-8的分辨率为79.4，S-8的分辨率仅为67.6%。因此，通过D101分辨率达到94.7%，AB-8达到79.4%，而S-8只有67.6%。故采用吸附率及分离率评价表明,D101在废弃烟叶中芦丁分离纯化方面具有良好的效果。表2-2不同树脂对烟叶芦丁的吸附及解吸性能树脂型号上样量/mg吸附量/mg吸附率/%解吸量/mg解吸率/%D10110.749.5786.38.6994.7S-810.749.3788.26.0367.6AB-810.748.4778.87.6679.42.4D101树脂柱层析分离废弃烟叶中芦丁的技术条件研究（1）上样液浓度上样液中芦丁浓度对于D101树脂吸附过程的影响见图2-7。浓度越高，芦丁对树脂的吸附量越小，当浓度为2mg·mL-1时，吸附效果最好，而在2mg.mL-1浓度以上吸附效果反而降低，这可能是由于随着芦丁浓度的升高，其它杂质含量随之升高并与芦丁形成了更大的竞争而导致杂质在树脂上吸附增加而芦丁吸附降低。并且在试验中还发现芦丁的浓度超过2mg.mL-1后，上样液色泽变暗，黏稠度显着增加，可能都会影响树脂吸附效果。图2-7上样液中芦丁浓度对树脂吸附效果的影响（2）洗脱液中乙醇浓度溶液中芦丁的浓度对吸附在D101树脂上的作用如图2-7所示。洗脱液中乙醇浓度越高，对芦丁的脱附作用越差。当解吸液的乙醇浓度大于50%，解吸效果明显增大。随着乙醇体积分数的增加，解吸液的芦丁浓度增加，解吸效果逐渐增强。乙醇浓度70%时，解吸液中芦丁的浓度越高，故使用解吸液中70%乙醇的含量最高。图2-8洗脱液中乙醇浓度对解吸效果的影响（3）上样流速度及体积按照上述步骤，以管数为横坐标，动态吸附浓度为纵坐标，绘出样品在各个流量范围的吸附动态曲线，如图2-9所示，对比4种流量下曲线，得出流速越大，泄漏发生的时间就越早，并且在泄漏发生后吸附率将迅速降低。以上述样液浓度10%即0.2mg.mL-1作为泄露点，以到达泄露点为上层样液终点得到的上层样液体积进行计算，得到上层样液所需时间结果如图2~10所示：当上层样液速度为1、2、3、4mL·min-1时，上层样液体积分别为106mL、98mL、84mL和70mL;所需时间分别为106min、49min、28min和17.5min。流速愈慢，上样量愈多，需要的上样时间愈长。选用流速时要考虑上样量太小对树脂性能发挥不利，上样时间太长又会使生产周期加长，造成效率下降加大成本。综合考虑两个因素，本次实验选择了2mL.min-1作为上样流速和98mL的最优上样量。图2-9不同上样流速的动态吸附曲线图2-10不同上样流速度的上样体积和所需时间（4）洗脱流速及洗脱体积根据前面介绍的步骤，将管号作为横坐标、流出液芦丁浓度作为纵坐标画出各个流量下洗脱曲线图2～11。从图中可以看出流速愈慢洗脱液芦丁浓度愈高，到达洗脱终点的管数愈少且峰型愈好（2mg.mL-1），流速愈快拖尾现象愈严重。将流出液到达洗脱终点时所使用乙醇体积作为洗脱体积并计算出洗脱所用时间的结果如图2-12中，当洗脱流速为1,2,3,4mL.min-1时，洗脱体积约37mL,38.7mL,45mL,50mL,需要洗脱时间约37min,19.25min,15min,12.5min左右。洗脱流速较快需要较大的乙醇体积，不仅使得洗脱率下降，增加了成本而且有可能给后续的样品处理带来一定的难度，所以洗脱体积较小，也就是说流速较小时效果更好。但是流速太慢会使生产周期变长引起效率降低加大成本，所以考虑到此实验选取2mL.min-1作为合适的洗脱流速和38.7mL乙醇体积。图2-11不同洗脱流速的动态解吸曲线图2-12不同洗脱流速度的洗脱体积和所需时间（5）验证试验根据前面介绍，冷冻干燥所得粗提取经称量制备成2mg.mL-1左右上样液100mL,2mL.m-1的上样完成后，使用20mL蒸馏水冲洗掉树脂表面没有吸附的杂质，再使用约40mL的70%乙醇从树脂床中脱附至2mL.min-1。采集洗脱液每管5mL循环利用以获得较上样液（4~8份）更高浓度。采用三氯化铝显色法测定芦丁的含量并验证其最佳提取富集工艺。结果表明，废烟叶中芦丁的含量约为4.9mg·g-1，最优提取工艺下粗提物中芦丁的平均含量为11.81mg·g-1,提取率95%。用大孔树脂浓缩，芦丁含量平均85.03mg.g-1左右，纯度7.2倍左右，回收率86.8%。结论本文优化了超声波辅助乙醇提取废弃烟叶芦丁的提取工艺及大孔树脂分离富集提取液中芦丁的工艺。最佳提取工艺为液料比30mL·g-1，乙醇浓度33%为提取液，57℃下超声时间20min，提取3次。最佳的分离富集工艺为采用D101型树脂，上样浓度2mg·mL-1，流速2mL·min-1，平均上样量约3.18mL·cm-3；洗脱剂乙醇浓度为70%，流速2mL·min-1，洗脱剂用量平均约1.28mL·cm-3。在优化的提取分离工艺下，采用三氯化铝显色法测定芦丁含量，结果表明废弃烟叶中芦丁含量约为4.9mg·g-1；粗提物中芦丁的平均含量11.81mg·g-1，经大孔树脂富集后平均含量85.03mg·g-1，芦丁纯度可提高7.2倍，平均回收率为86.8%。总之，与经典甲醇热回流萃取植物组织中芦丁方法相比较，本研究对提取液中芦丁快速测定方法进行了比较和分析。虽不如国家标准中高相液相色谱法那样精密精确，但是该方法稳定性好，操作简便，比较适用于大批量样品检测及含量比较研究。同时超声波辅助乙醇萃取不但操作方便，显着缩短处理时间，而且乙醇价廉无毒，萃取效果和甲醇一样好。与常规溶剂萃取及硅胶柱层析法相比，大孔树脂分离富集方法操作简便，可以反复利用，而且不需要乙酸乙酯，氯仿等有机溶剂，既环保又节省成本减少能耗。参考文献[1]柯翠敏,李丝红,胡建萍,谢志新.运用响应面分析法优化鬼针草总黄酮的提取工艺[J].继续医学教育,2022,36(03):109-112.[2]李星,李静.槐米中芦丁提取工艺研究进展[J].现代农业科技,2022(03):214-216.[3]姚佳,潘利平,龙应霞,张欢欢.响应面法优化槐米中芦丁的提取工艺研究[J].生物化工,2021,7(05):54-57.[4]蔡前超,杜鸿章,曹智威,冯亚莉.槐米中芦丁提取工艺研究[J].生物化工,2021,7(01):93-95.[5]李锐,李皎皎,张聪聪,周茜,高荣琨.不同地区的紫苏种子中总黄酮的提取方法及其含量研究[J].激光生物学报,2021,30(01):91-96.[6]罗进,罗艳萍,张风,冯婉怡,罗汝锋.槐米中芦丁提取工艺优化研究[J].现代食品,2020(19):93-96+105.DOI:10.16736/41-1434/ts.2020.19.030.[7]胡心茹,李甜雨,陈奕江,马小思,袁施怡.槐米中芦丁的含量测定及其稳定性研究[J].海峡药学,2020,32(08):29-32.[8]张琳,杨范莉,张祺嘉钰,白婷,张小飞,杨新杰.不同提取方法对不同产地麦冬中芦丁和麦冬多糖含量及其抗氧化活性的影响[J].西北药学杂志,2020,35(03):317-321.[9]陈璐,耿柏林,郭禄晶,苏星超,强力源,郑立颖,李欠.不同产地槐米中芦丁的提取及含量测定比较[J].农业科技与信息,2020(08):58-60.DOI:10.15979/62-1057/s.2020.08.023.[10]李杰,李钟杰,雷高明,李婼楠,尚孟文.响应面法优化槐米中芦丁的溶剂热法提取工艺[J].中国食品添加剂,