柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达

柠檬明串珠菌柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达

摘要为高效表达柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶，培养含柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，但该外源基因只有在诱导剂的作用下才能正常表达，因此，本研究通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷作为诱导剂，通过SDS分析其表达量，探究不同诱导温度、诱导时间与IPTG浓度对D-乳酸脱氢酶的影响，确定最优表达条件；采用镍柱亲和层析的方法进行酶的纯化，对纯化酶采用聚乙二醇填埋法浓缩，达到纯化浓缩D-乳酸脱氢酶的目的。结果表明：诱导温度为20℃、诱导时间为16h、诱导IPTG浓度为0.5mM时，D-乳酸脱氢酶的表达量最高；对纯化后的酶液使用聚乙二醇填埋法浓缩过夜后，所得上清目的蛋白量增多。本研究为高效表达柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶提供理论支持，对食品工业和医药保健等领域应用有重要意义。关键词：D-乳酸脱氢酶；柠檬明串珠菌；IPTG诱导；SDS凝胶电泳；纯化浓缩

目录TOC\o"1-3"\h\u引言 材料与方法实验材料与仪器试验菌株表达了柠檬明串珠菌KM20D-乳酸脱氢酶重组质粒的大肠杆菌为延边大学农学院食品与生物科学系实验室的保存菌株。主要试剂LB液体培养基、LB固体培养基、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、PBS缓冲液、卡那霉素、HCl、Na2HPO4、KH2PO4、咪唑、尿素、Tris-Base、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲醇、乙酸、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)凝胶制备试剂盒、考马斯亮蓝R-250，购于北京索莱宝科技有限公司；NaCl、KCl、乙醇，购于天津科密欧化学试剂有限公司。表1-1溶液配制表Tab.1-1Preparationofsolution溶液名称成分pH其他缓冲液A（平衡液）PBS缓冲液HCl调节pH为7.4高压灭菌4℃保存缓冲液B144g尿素，1.8gTris-HCl，5.26NaCl，300mL蒸馏水HCl调节pH为8高压灭菌4℃保存洗杂液A30mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液HCl调节pH为7.4高压灭菌4℃保存洗杂液B50mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液HCl调节pH为7.4高压灭菌4℃保存洗脱液500mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液HCl调节pH为7.4高压灭菌4℃保存IPTG(100mM)2.4gIPTG，100mL灭菌水--20℃贮存卡那霉素(30mg/ml)30g卡那霉素，100mL灭菌水--20℃贮存注：表中“-”表示无需调节该溶液的pH值，所有溶液均需0.22μm过滤膜过滤。仪器与设备表1-2仪器与设备Tab.1-2Instrumentsandequipment名称厂家型号超声波细胞破碎仪杭州米欧仪器有限公司UCS-650雷磁pH计上海仪电科学仪器股份有限公司PHS-3C超低温冰箱美国NUAIRE公司NU-9668E超净工作台上海新苗医疗器械机械制造有限公司SW-CJ-IFD电热恒温培养箱上海新苗医疗设备有限公司DNP-9082BS-Ⅲ高压蒸汽灭菌器日本TOMY公司SX-700冷冻离心机莱比信(中国)科技发展有限公司Z400KSDS电泳仪美国Bio-Rad公司1658001电子分析天平上海天平仪器有限公司FA1104恒温培养振荡器上海智城分析仪器制造有限公司ZWY-100H/240恒流泵上海精科实业有限公司HL-2Ni2+-NTA柱瑞典GEHealthcare公司1658001透析袋美国VISKASE公司MD4416实验方法柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶的诱导表达条件优化依照张英龙等人REF_Ref15288\r\h[15]的方法，修改如下：挑取单克隆菌落在LB固体培养基上划线，在37℃条件下恒温过夜培养。随后在固体培养基上挑取单一菌落接种至LB液体培养基中进行培养活化，并于37℃、180rmp下恒温振荡12h，然后按1:50的比例将菌液接种至100mL的LB液体培养基中。当OD600值达到0.6时，在IPTG诱导浓度为0.5mM，分别在37℃与20℃下诱导培养8h，通过SDS分析最适诱导温度；在最适诱导温度条件下，IPTG诱导浓度为0.5mM，分别诱导培养4h、8h、12h、16h，通过SDS分析最适诱导时间；在最适诱导温度和最适诱导时间条件下，IPTG诱导浓度分别为0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM，诱导培养16h，通过SDS分析最适诱导浓度REF_Ref15327\r\h[16]。在活化菌株时，由于构建大肠杆菌质粒时卡那霉素抗性基因连接至终载，所以向LB培养基中加入卡那霉素（30μg/mL），可以去除杂菌得到相应菌种。D-乳酸脱氢酶粗酶液的制备收集经IPTG诱导后的菌液，于4000r/min下离心10min，弃上清，收集菌体并按25:2的比例加入缓冲液A混匀，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，破碎时间为15min（开5S，关5S），破碎过程采用冰浴方法，制造低温环境，保证酶活力。破碎后所得D-乳酸脱氢酶粗酶液。将粗酶液用冷冻离心机在4℃下、12000r/min离心5min，分别收集上清蛋白与沉淀，并按照1:1的比例向沉淀中加入缓冲液B裂解菌体，4℃保存。D-乳酸脱氢酶的纯化浓缩根据IPTG诱导结果，选择最优的表达条件，并按1.2.1与1.2.2的步骤，制备上清样粗蛋白样液。纯化上清样时，向层析柱中加入5倍柱床体积的缓冲溶液A，清洗并平衡层析柱。通过恒流泵将上清粗蛋白样液流穿层析柱，用离心管接住流穿液，反复上柱3次。根据蛋白His标签D-乳酸脱氢酶纯化时采用Ni2+亲和层析法，多次反复上样能使上清样中的粗蛋白与Ni2+-NTA柱填料充分结合。随后，先用洗杂液A和洗杂液B进行两次洗杂，再经过洗脱液缓慢进行洗脱，收集洗脱流穿液REF_Ref15373\r\h[17]作为纯酶液在4℃下进行保存。取20mL纯化后的酶液装入透析袋中，透析袋埋在聚乙二醇中浓缩过夜。SDS检测方法对诱导表达条件优化以及纯化浓缩后的结果进行SDS检测，具体操作如下。装板用密封硅胶框将凹型玻璃与平玻璃夹住，并垂直放入玻璃胶室内，即可灌胶。制胶按表1-3中溶液的顺序及比例制备凝胶，分别配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。表1-3SDS凝胶制备Tab.1-3PreparationofSDSgels试剂名称12%分离胶5%浓缩胶总体积10mL5mL30%制胶液(29:1)4mL0.83mL1MTris-HCL(pH6.8)0mL0.625mL1.5MTris-HCL(pH8.8)2.5mL010%SDS100μL50μLddH2O3.3mL3.42mL10%PAGE胶凝固剂100μL75μLPAGE胶促凝剂10μL7.5μL最佳分离范围12-60kD-上胶将配好的12%分离胶溶液缓慢加入制胶板之间REF_Ref15422\r\h[18],待分离胶距短玻璃上沿2cm处停止加入，用移液枪贴近胶液界面加入蒸馏水,以防止溶液蒸发并保证胶面平整,待分离胶聚合后倒去水层用滤纸吸去残液。用移液枪将制备好5%浓缩胶溶液加在分离胶面上,充满制胶板，插入样品梳REF_Ref15422\r\h[18]。样品处理将10×LoadingBuffer稀释至2×LoadingBuffer并分别与上清样、沉淀样等体积混合，在沸水中煮5min后冷却至室温备用。上样将预制胶放入电泳槽中，并灌入新配置的电泳缓冲液，外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可，注意避免电泳槽内出现气泡，待缓冲液浸过加样口后小心拔出梳子，防止加样口变形。用移液枪注入Marker5μL，上清样和沉淀样分别注入10μLREF_Ref15494\r\h[19]。电泳上样完毕盖上盖子，先将电压设置为80V，样品进入分离胶与浓缩胶的临界处时，将电压变为120V。当样液移动至距离玻璃底端0.5～1cm处停止电泳，在电泳过程中保持电流稳定。染色、脱色电泳结束后关闭电源，将2块玻璃板取出，用刀片轻轻插入凹槽玻璃的顶部与另一玻璃板之间的缝隙，轻轻向上撬，上层玻璃轻轻撬开进行剥胶[20]。使用考马斯亮蓝R-250溶液在室温下染色1h，用蒸馏水脱色至背景无色后将凝胶平整放置于玻璃板上，拍照扫描条带REF_Ref15494\r\h[19]。结果与分析不同诱导温度对D-乳酸脱氢酶表达条件的影响M:蛋白标样；1：37℃时粗酶样液；2：37℃是上清样；3：37℃是沉淀样；4：20℃时粗酶样液；5：20℃时上清样；6：20℃时沉淀样图2-1SDS分析IPTG不同温度下诱导蛋白表达Fig.2-1SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferenttemperature将两种样本置于IPTG浓度为0.5mM环境中，分别诱导表达8h进行比较。如图2-1所示，蛋白表达量经过SDS电泳分析显示，约为40kDa处有明显的特异蛋白条带。当诱导温度为20℃时，粗酶、上清样、沉淀样诱导的表达量整体比37℃诱导的表达量更多。因此，诱导温度为20℃时表达效果最佳。根据邱昱REF_Ref15572\r\h[21]等实验结果表明，D-乳酸脱氢酶在降低温度诱导时，由于菌体转录翻译的速度有所减慢，导致可以形成更多正确折叠构象的蛋白，这一现象促进了D-乳酸脱氢酶的可溶性表达，且在20℃条件下诱导表达出的D-乳酸脱氢酶主要以可溶性形式存在。不同诱导时间对D-乳酸脱氢酶表达条件的影响M：蛋白标样；1：诱导4h的上清样；2：诱导8h的上清样；3：诱导12h的上清样；4：诱导16h的上清样图2-2SDS分析IPTG不同时间下诱导蛋白表达Fig.2-2SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferenttime由于沉淀蛋白是由于错误折叠所致，不能表达活性，因此后续实验只对上清蛋白表达条件优化的结果进行检测。选择最优诱导温度20℃，在IPTG浓度为0.5mM环境下，对不同的诱导时间进行比较。如图2-2所示，蛋白表达量经过SDS电泳分析显示，约为40kDa处有明显的特异蛋白条带。随着诱导时间的增加，该酶的表达量也随之增加，该时间段内其诱导表达效果与诱导时间呈正相关，16h后该菌株由对数生长期进入衰老期，其诱导效果随之降低。因此，诱导时间为16h时表达效果最佳。根据研究结果表明REF_Ref15618\r\h[22]，随着诱导时间的延长，重组蛋白酶可溶性表达量增加。不同诱导浓度对D-乳酸脱氢酶表达条件的影响M:蛋白标样；1:IPTG浓度0.25mM的上清样；2:IPTG浓度0.2mM时的上清样与沉淀样；3:IPTG浓度0.75mM时的上清样；4:IPTG浓度1.0mM时的上清样图2-3SDS分析IPTG不同浓度下诱导蛋白表达Fig.2-3SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferentconcentrations选择最佳诱导温度20℃、最佳诱导时间16h，对不同的诱导浓度进行比较。如图2-3所示，蛋白表达量经过SDS电泳分析显示，约为40kDa处有明显的特异蛋白条带。各浓度之间进行相比，诱导剂浓度为0.5mM其诱导效果好于其他组，且浓度为0.5mM时沉淀量最多。因此，诱导浓度为0.5mM时表达效果最佳。在邱昱REF_Ref15572\r\h[21]等优化实验结果中也表明，在低浓度条件下诱导时，重组蛋白酶主要以可溶性形式存在，当用较高诱导时，重组蛋白酶主要以包涵体的形式存在，且在0.5mM时D-乳酸脱氢酶以可溶性形式存在最多，与本实验结果一致。柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶浓缩结果M：蛋白标样;1：浓缩上清样;2：浓缩沉淀样图2-4SDS分析浓缩蛋白表达Fig.2-4ExpressionofproteinconcentratebySDS由图2-4可知，蛋白表达量经过SDS电泳分析显示，约为40kDa处有明显的特异蛋白条带。20ml纯酶液经透析过夜后所得纯化浓缩酶液约为0.5ml，经SDS电泳分析结果显示目的蛋白含量明显增加，浓缩成功，目的蛋白其水溶性得到了提高。结论在IPTG诱导大肠杆菌中柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶表达时，探索出最优诱导温度为20℃、最优诱导时间为16h、最优诱导浓度为0.5mM。柠檬明串珠菌D-乳酸脱氢酶经诱导表达后，采用Ni2+-NTA柱亲和层析法进行纯化，纯化后的菌液经聚乙二醇填埋法浓缩后，D-乳酸脱氢酶含量有所增加，上清样中的蛋白表达量明显增加，其水溶性增加。参考文献CHUNBH,KIMKH,JEONHH,etal.Pan-genomicandtranscriptomicanalysesofleuconostocmesenteroidesprovideinsightsintoitsgenomicandmetabolicfeaturesandrolesinkimchifermentation[J].ScientificReports,2017,7(1):118-119.卢宏皓,刘昭明,黄翠姬,杨忠平,虞珂娜,张开翼.柠檬明串珠菌接种发酵竹笋过程中的化学成分变化[J].食品科技,2021,46(07):87-93.DOI:10.13684/ki.spkj.2021.07.015.CHOIIK,JUNGSH,KIMBJ,etal.NovelLeuconostoccitreumstarterculturesystemforthefermentationofkimchi,afermentedcabbageproduct[J].AntonieVanLeeuwenhoekInternationalJournalofGeneralandMolecularMicrobiology,2003,84(4):247-253CHOIYJ,YONGS,LEEMJ,etal.Changesinvolatileandnon-volatilecompoundsofmodelkimchithroughfermentationbylacticacidbacteria[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2019,105:118-126.韩瑨,刘振民,郭本恒,吴正钧.柠檬明串珠菌的研究进展[J].食品研究与开发,2014,35(16):126-131.郑毅男,刘可越,徐宝军,韩立坤.桔梗抗肥胖机理试验研究[J].吉林农业大学学报,2002,24(6):42-53华东理工大学.粘质沙雷氏菌D-乳酸脱氢酶基因,克隆、表达重组菌株及重组酶的研究:CN200910054467.3[P].2011-01-12.钱国军,陈彩平,翟如英,邵蔚蓝,梅艳珍.极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质[J].生物工程学报,2014,30(04):545-553.DOI:10.13345/j.cjb.130456.SIMONES,PLANTER,WHITESIDESGM.D-lactatedehydrogenase.Substratespecificityanduseasacatalystinthesynthesisofhomochiral2-hydroxyacids[J].Appliedbiochemistryandbiotechnology,1989,22(2):169-179.袁剑,秦浩,葛向阳,张伟国.干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质[J].微生物学通报,2011,38(10):1482-1487.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2011.10.026.汪多仁.L-乳酸的开发与应用进展[J].饮料工业,2008(02):11-18.刘鹏,李爽,贾晓强,闻建平,财音青格乐.基因工程菌生产D-乳酸研究进展[J].现代化工,2010,30(10):13-17+19.DOI:10.16606/ki.issn0253-4320.2010.10.001.宋嘉宁,黄志兵,刘珞,谭天伟.肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].北京化工大学学报(自然科学版),2012,39(02):79-83.莫征杰.植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的异源表达及条件优化[D].浙江大学,2014.李卓.人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D].第四军医大学,2017.张英龙.德式乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达[J].南方农机,2017,48(22):70-72.BERWALR，GOPALANN,CHANDELK,etal.Plasmodiumfalciparum:Enhancedsolubleexpression,purific