高效液相色谱法测定益气消肿合剂中葛根素的含量

绪论益气消肿合剂是由葛根、黄芪、百合、西瓜、党参等17种草本植物经煎煮、过滤、浓缩而成的医院制剂。风湿病为猕猴桃虚血瘀阻，痰湿阻结。葛根是本方的主药之一，故选用其代表成分作为葛根素制剂质量控制的指标，葛根素含量的测定方法有多种，多采用经典液相色谱法。本篇论文的实验采用了液相色谱法（HPLC）其中葛根素是本制剂的主要成分。对本制剂全面质量的评价和各种体质的适应症，提供了用药安全性和疗效的数据，更加精确的方便临床用药有指导作用和提高用药安全性。1.1流动相的选择通过实验比较乙腈-水棒结构、乙腈-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液(C)、棒对葛根素生产过程中的影响，流动相的选择，最终乙腈-0.5%磷酸溶液选项是3种活性成分作为的流动相梯度洗脱方法。1.2提取溶剂的选择将配制好的益气消肿合剂小心称取1.0g于装有缓冲液的25mL锥形瓶中，然后按3.2%甲醇溶液为溶剂中的配方分份配制供试液。有关资料查明。当提取液为75%甲醇溶液时，葛根素提取率最高，故选用75%甲醇溶液作为溶剂提取。1.3国内外研究现状1.3.1薄层色谱法（TLC）本色谱法在天然药物中运用很广，在中成药方面主要是药理鉴定、卫生检测和简单测定。小规模色谱使用RF进行定性和定量分析。每一个目标的组分对同一性吸收剂都是有着各种不近相同的吸附和解吸的各种功能，因此流动的相在涂层板上。停止在解吸的介质系统达到了分离的目的。软色谱法具有分析快速、高效、经济、应用简单等优点，尤其在各种测定没有紫外吸收光中成药制剂的药品。丁刚马等。发现贝母煎桃治疗狼疮，在TLC方法中使用清晰、易懂、简单。吴迪姆等人。测试了药典丹参片的薄层色谱鉴别系统，开发并建立了新的系统，克服了药典系统的弱点。小规模层析技术在层析板的生产、切割工艺的细节、开发人员的发展、应用的准确性等方面发展迅速。小规模色谱在中国医药行业中仍占有独特的地位。1.3.2气相色谱法(GC)气相色谱法使用氢气、氮气和其他气体作为检测方法，将目标材料和混合物从燃烧时间和细胞系统之间的分布速率差异中分离出来。时间也包括在停止时间中。对性和量检测数据评估是不同的，并没有最终达到预期目标而失败研究。气相色谱在中成药制剂的方面使用都是较为常用的方法，尤其是在测定芳香气味的中成药剂型研究中，具有没有其他的替代的效益。刘宇和他的科研团队在研发以氮气为气体充入胶囊研发新剂型的檀香通脉胶囊，然后用色谱气体在同一个时间点检测冰片和薄荷醇的剂量，并促进加热和溶剂方案以提高牢固度。本色谱法可以检测对中成药的性的鉴定和量的鉴定，但同时可以检测混入物料中的杂质和有毒物质。目前，中药制剂技术主要采用色谱法（GC）和质谱法（MS）。李红梅和他的团队。研究了现在市场上备受追捧的藿香正气水的GC指纹图谱，通过选择单一厂家的最佳提取方法和色谱方法，对10种不同类型的藿香正气水较为细致的分析。陆方明和他的团队等人。比较稳健的微萃取技术，获得芬芳的香炉，比较GC-MS技术与不同类型香炉的指尖。提供大量云木香的成分相关的数据。气相色谱法虽然在药物研究上有局限性的，现在研发方面发展，很有可能在中药研究领域相当高的层次。1.3.3高效液相色谱法(HPLC)高水色谱在许多领域都发挥着独特和引领作用，主要是表现在中成药制剂药品管理质量上，占有领先地位。高效液相色谱在中成药剂型中的有效含量检测、代谢药理、重金属遗留和有害物质测定各种方面都有研究。鲁丹和很多科学家在天南星科使用LichrospherC18作为HuzhangNanxing的色谱柱，从HPLC中描述几种核苷和中国化合物。有效成分为乙腈-0.1%荨麻疹。超过98.9%，RSD小于3%。WangShili等人以DiamonsilC18为色谱柱，研究了贵州产的儿茶素和红麻。综合考虑不同影响，采用高水色谱法有效测定含量。最终研究结果发现，这四个维度是可变的。业绩在细线内，恢复率超过97%。周国军等利用高效液相色谱法对丹参的五种成分进行了研究，提出了防治完全丹参的潜在解决方案。高效液相色谱系统在中成药制剂有效成分的提取制备中的应用有很多，但每项研究都有其独特和创新的特点。同时，中药制剂中一种或多种成分的同时测定是芍药甙、甘草苷、橙皮苷、麻黄碱、葛根素等各类研究人员深入研究的课题。1.3.4葛根素的药理学及其临床应用研究进展葛根素它具有很多最有效的主要成分异黄酮，具有治疗和良好的健康益处。作为一种生物活性物质，嘌呤碘被大量的科学家研究。根据一些报道，葛根素被一些中药学家研究发现具有扩张动脉血管、保护心血管、抗炎症、抗氧化、抗酒精运动障碍的作用；此外，葛根素引起的慢性糖化高血糖也可能抑制内皮产物的发生。对治疗糖尿病和眼部的疾病；葛根素还能阻止帕金森氏细胞中各种基因的表达，具有相同的雌激素活性，可用于预防月经。嘌呤具有惊人的俗气效果以及特殊的外观，在健康应用和产品开发方面具有巨大潜力。以下是葛根近年来重要医学研究的介绍。（1）葛根素及其糖苷化衍生物毒理学评估葛根素是一种具有良好生物利用度的异黄酮，但过多的异黄酮会产生毒性作用。Hyuk等人对口服葛根素及其苷类的实验研究。在Ames试验中，嘌呤和甙类的致突变性小于200mg/板，可使硝基喹啉的转化率降低41%。骨髓上移植微核ACE、嘌呤或ICR糖苷没有阻碍红细胞产生，两种离子均增加多染红细胞增殖。口服Sprague-Dawley嘌呤和糖苷28天，小鼠的细胞、生化和血液水平没有显着发生变化。对此研究结果可以看出，嘌呤和甙类药物在体外和体内都没有明显的毒性，至少在小鼠体内每天剂量为250mg/kg时是这样。（2）葛根素植物雌激素活性更年期女性会因雌激素缺乏而出现多种阴性症状和全身性症状，如心脏病、冠心病、骨质疏松疾病等。替代雌激素的疗法可以大量运用于治疗正在处于更年期妇女的发烧、尿道感染、骨质疏松疾病、心血管病和肠癌，但是长期使用雌激素会加大出血或扩大子宫并增加患乳腺癌的机会。不过，大多数人但是希望于一种更好的替代激素的治疗法，植物雌激素引起了研究人员的关注。葛根素是一种天然植物雌激素受体，具有类似雌激素的生物利用度，可减轻女性更年期症状。Phongthorn等人。不同剂量葛根素对更年期症状的影响已在人体中进行了试验，结果表明25mg和50mg葛根素对更年期症状有积极作用，但两种作用差异不显着。子宫切除术对更年期妇女安全有效，临床上可使用低嘌呤治疗妇女更年期症状。Hataitip等人。为了评估促性腺激素对人体雌激素水平的干扰，以绝经期使用作为实验因素，结果表明葛根可能会降低绝经期动物的促性腺激素和树脂水平。剂量直接相关，停药后促性腺激素水平会逐渐恢复到原来的水平，恢复时间与使用的剂量有关。这表明动脉具有雌激素样活性，可与其他药物联合使用以治疗女性更年期症状。唐一友利用植物雌激素诱导的MG-63转录细胞对雌激素有不同的合法反应，结果表明葛根素对系统有积极作用。（3）葛根素解酒护肝功效中草药用于治疗酒精与葛根。张等人。在小鼠身上观察到葛根在酒精中的治疗作用。研究表明，嘌呤可以很好地预防酒精后的行为问题。防锈。它通过抑制血管行为、增加酒精损伤和恢复神经系统中抑制的GABAAR细胞来增加加压素活性。酒精会导致骨髓细胞中的脂肪，并可能导致股骨头坏死。目前，医学上尚无能有效预防骨坏死的药物。Wang等人研究了波多黎各酒精脂肪生成和骨坏死的治疗效果。骨钙素、骨钙素成分和骨钙素mRNA含量提高；在体内检查中，酒精小鼠出现骨坏死、脂肪细胞增殖和增生、骨造血减少和股骨软骨排列，尽管上面没有提到。Purren的团队，但实验数据表明，puerrin可以停止饮酒。脂肪由骨髓细胞运输以防止股骨头坏死。Lucas和研究人员通过静脉注射NPI-031来减少男性的饮酒量。从实验结果可以看出，该药有效，没有任何体征和症状。或者摆脱葛根可以减少40-50%的每周饮酒量和避免饮酒的空闲时间。因此，大厅NPI-031有望用于葛根，以减少酒精和酒精消耗等。黄等人。四氯化碳参与肝癌的诊断和宫颈癌的预防。结果表明，葛根对小鼠四氯化碳和肝损伤有积极作用。这种保护功能可能是通过抑制细胞色素2E1活性和降低谷胱甘肽和谷胱甘肽-S来介导的，这可能会拮抗肝脏上面四氯化碳损坏。并且，嘌呤还对三氯甲基自由基减少的发生，起到脂质过氧化作用，是抗氧化、清除自由基、阻止肝细胞损伤的主要原因。（4）葛根素促进骨组织代谢及抑制帕金森症的研究骨髓是体内的具有分布广泛的器官，在其一生中不断变化和再生，雌激素可能负责保持骨细胞的代谢。虽然不推荐使用这种方法，但相关科学家发现，绝经期女性的低雌激素水平会导致骨质流失。治疗骨质疏松症是现代医学的研究话题。虽然通过接种疫苗本身重建骨髓缺损被认为是最优方案，但它仍然存在挫折，例如对产道的破坏以及大小和大小。通过使用先进的细胞引擎工程技术，使用各种生长因子、成骨细胞和导致骨髓移植的中间生命增强剂，骨细胞重塑效果最佳。这些因素可以促进骨细胞的快速生长，最终缩短愈合时间。来自天然葛根素的雌激素-异黄酮组合在预防和治疗骨质疏松症方面受到了特别的关注。该患者未进行骨髓移植，与骨骼肌缺陷有关。李彬彬等研究表明，葛根素能刺激碱性磷酸酶（ALP）和成骨细胞的合成和还原，而ALP是成骨过程中重要的海洋标志物。骨髓，因此，葛根素可以被认为对骨密度有益。葛根素在体外可以显着改变细胞结构并改善骨髓功能。帕金森病(PD)是一种由中枢神经系统中多巴胺神经元和黑质缺失引起的慢性神经系统疾病，是该疾病的最常见形式。中国目前约有172万人被诊断患有帕金森病，每年报告的新病例约10万例，但仍有数千例新病例未被发现。帕金森病仍然未知。遗传因素、环境因素、衰老和氧化应激可能是导致多巴胺神经病变和死亡。多巴胺中有一种左旋多巴，现在是治疗帕金森病的最佳方法。不幸的是，暴饮暴食可能是有害的。使用中草药治疗帕金森病在我国有着悠久的历史，因此中药已成为治疗帕金森病的新药源。众所周知，雌激素可以预防和治疗帕金森病。异黄酮除此之外还有不同的作用。葛根素活化异黄酮保护多巴胺神经系统在实验研究中已经表明葛根素可以预防帕金森病小鼠，调节MPTP（海洛因合成）神经损伤，这种保护机制及其大的可能与细胞凋亡相关。研究了葛根素全异黄酮对帕金森病细胞中基于MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶离子)的抑制剂如脑啡肽原、前去诺啡和D2多巴胺mRNA表达的干扰。实验数据表明，与对照组作比较，MPP+组D2多巴胺受体mRNA和前脑啡肽受体mRNA表达出现正相关，而前诺啡受体mRNA表达出现向下的。与MPP+组作比较，葛根异黄酮组D2多巴胺受体mRNA有很大的变化，受体mRNA加大，但mRNA发现没有现象。通过数据可以发现Panisoflavones影响帕金森氏细胞中D2多巴胺受体mRNA的表达和前地诺啡mRNA表达加大效果，但是对于前脑啡肽的表达没有影响。2仪器与试药2.1仪器高效液相色谱仪；烧杯；试管；电子分析天平（AUY325型）；KQ-350B型超声波清洗器：功率300W，频率30kHz（江苏超声仪器有限公司）。2.2试药葛根素（批号2022009）、成分测定符合中国药典标准，一袋6g，批号202205，江西南昌药都樟树药业有限公司出具；色谱纯甲醇和乙腈购自英国DIKMA公司，试验水为液体，益气消肿合剂.规格 ：药用每袋7g,批号：（202201）。3方法与结果3.1色谱条件C18色谱柱（4.6mm×250mm，5m），流动相：乙腈0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～5min，24%A；5～10min，24%A→28%a)，波长频率0～4.0min，250nm；；流速1mLmin-1，柱温30℃，进样量20µL，最大流速。色谱图见图3-1。图3-1益气消肿合剂HPLC图3.2溶液的制备3.2.1对照品溶液的制备准确称取葛根素6g，以30ml50%甲醇溶液，回流提取2小时在温度没有降之前抽滤、在加入400ml50%甲醇溶液中回流40分钟，温度没有完全降之前抽滤，两次溶液合并加热，50度温度下调节PH1-2,用甲醇溶解25mL，摇匀，得到484.1μg·mL-1的剂量。得到276.0·g·ml-1的标准比例溶液1份。量取葛根素单位溶液4.0ml，加甲醇溶解于等体积的25mL大容器中，摇匀，配制成与I（葛根素）77.44相同的参考储存溶液µg·mL-1。3.2.2供试品溶液的制备称取益气消术合剂中的药品，置研钵内研成细分，研磨之后混合均匀，精密称取研磨后的粉剂1.0g100mL锥体天平称取，然后加入50mL75%甲醇，超声40min，冷却，再次称重，补充75%甲醇损耗，用力充分摇匀，得到0.45µm膜。3.3方法学考察3.3.1线性关系考察精密量取葛根素的对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别将他们置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，得到6个对照品溶液并且浓度不同，分别向色谱进样20μL测定峰面积。以峰面积纵坐标浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y=389.91x+268.56（r2=0.9989），表明葛根素在0.0027至0.0163mg/ml浓度范围内线性关系良好。3.3.2精密度试验精密的称取供试品溶液放入25mL容量瓶内，按照“线性关系曲线的绘制”项下，以相应试剂作为空白对照组，在曲线波长是310nm处吸光度。多次，计算吸光度的RSD为0.75%，表明仪器精密度良好。结果见表1。表1精密度结果次数123456 RSD(%)A486.3484.7484.7483.3483.9493.30.753.3.3重现性试验依照上面的实验，在称取5组样品，批号为2022002。根据色谱条件下，将19µL注入HPLC仪器，每个组分的份数最多。实验结果可以看出，葛根素RSD为1.66%，表明实验成功，如表3-2。表2重现性结果序号12345RSD(%)含量（%）254.1257.5258.3 257.1 249.6 1.663.3.4稳定性试验量取20ml实验中使用的溶液注入HPLC中，按照上面的色谱方法，间隔20分钟测试一次，一共测定6次，测定吸光度。结果见下表，葛根素RSD分别为1.80%。这意味着测试溶液在6小时，考察实验的稳定性，如表3表3稳定性结果T(min)020406080100120RSD(%)A250.1251.9257.5258.3262.2257.1249.61.663.3.5加样回收率试验精密称取葛根素(批号2022003)的6个对照品,加入1ml葛根素的样品484.1g/ml中,按供试品溶液制备方法制备,精密吸取0.4mL,按“线性曲线的绘制”项下的方法操作，并以相应的试剂作为空白对照组，在波长291nm处测定吸光度。计算回收率,计算RSD为1.76%，本方法回收率较好。结果见表4。表4加样回收结果序号称样量样品中含量加入量测得量回收率平均回收率RSD（g）(mg)(mg)(mg)(%)(%)(%)11.00000.44590.44600.8911 99.721.00040.44610.44600.886298.731.00020.44600.44600.887098.9 99.1 1.764 1.0001 0.4459 0.44600.8901 99.65 1.0004 0.4461 0.44600.8833 97.96 1.0003 0.4460 0.44600.8790 97.13.4样品含量测定取批号为2022001、2022002、022/203的样品各6份，按表2各项配制供试品溶液的方法，于表3项下色谱条件对其进样检验，采用外标法计算含量，实验数据见表5表5益气消肿合剂含量测定结果样品号取样量 制剂产率 取黄芩苷 黄芩苷 平均含量（g）粗品（g）(%)粗品量（g）含量(%)(%)10.434631.680.0519 0.42120.445931.670.0501 0.430 0.43030.465931.700.0500 0.4404结语准确称取1.0g空闲时益气小柱，用塞子混合25mL锥形板，用70%甲醇溶液提取，固体和液体的比为1:40，超声时间为30min，其他的条件可以不变。，按照产品2的方法制备样品，将超声波功率设置为60、70、80、100W，结果表明本文三者的产率几乎没有差异元件，最后我们选择了超声波功率为80W。为更加准确地和科学地控制益气消中的混合质量，对实验提取液、超声的时间、固体与液体的比和超声功率更加系统的优化。最后我们确定了最适合提取条件为料液比1:40、75%甲醇溶液、超声提取400min（功率80W）。在实验讨论过程中发现有药物含有少量的杂质，测量过程中条件的变化对药物没有影响，可以看出中国药典对我国儿科药物的控制和检测难度大。参考文献[1]白梓静.高效液相色谱在中药含量测定中的应用[J].分析仪器,2014(06):8-11.[2]杜悦,王振华,岳青青.紫外分光光度法和高效液相色谱法检测食品塑料包装中荧光增白剂[J].塑料工业,2014,42(11):89-92.[3]黄雄峰,汪建民.葛根素的神经保护作用机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(04):224-230.[4]姜丽,余兰彬,徐国良,张启云,严小军,王玉蓉.天麻素和葛根素在大鼠体内联合应用的药动学研究[J].中国中药杂志,2015,40(06):1179-1184.[5]马博凯,勾新磊,赵新颖.高效液相色谱法在食品和药品安全分析中的应用[J].食品安全质量检测学报,2016,7(11):4295-4298.[6]张莹莹,周建斌,曾祥伟,赵凤鸣,刘光东,詹秀琴.葛根素对成骨细胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影响[J].中国药理学通报,2016,32(10):1457-1462.[7]袁媛,侯雪峰,封亮,贾晓斌,王永庆.葛根素对体内外晚期糖基化终末产物形成的抑制作用[J].中草药,2017,48(07):1386-1390.[8]邢志华,马誉畅,李新萍,张冰,张梦迪,万升敏,杨鑫,杨天凤,姜婧雯,包然.葛根素及其衍生物抗炎、抗痛风作用研究进展[J].中国中药杂志,2017,42(19):3703-3708.[9]李昕,潘俊娴,陈士国,徐维昌,金妙仁,叶兴乾.葛根化学成分及药理作用研究进展[J].中国食品学报,2017,17