2024高考生物二轮复习专题八生物技术实践考点二微生物的分离培养及应用学案

PAGE11-考点二微生物的分别、培育及应用1.图解识记微生物的培育、分别与计数2.熟记微生物分别与计数的两个实例（1）土壤中分解尿素的细菌的分别与计数：①筛选菌株：利用选择培育基筛选菌株。②测定微生物数量的常用方法：活菌计数法（或稀释涂布平板法）和显微镜干脆计数。③过程：土壤取样→样品稀释→微生物的培育与视察。④鉴定方法：含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培育基→细菌→指示剂变红，则该菌能分解尿素。（2）分解纤维素的微生物的分别：①试验原理：即：可通过是否产生透亮圈来筛选纤维素分解菌。②流程：土壤取样→选择培育→梯度稀释→涂布平板→选择菌落。3.理清微生物培育的“5”种基本技术（1）培育基的制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。（2）无菌技术：主要包括消毒和灭菌。（3）倒平板操作：待培育基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰旁边倒平板。（4）平板划线操作：平板划线法是通过接种环在琼脂固体培育基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培育基的表面。留意划线的方法（如图）。（5）稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列的梯度稀释然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培育基的表面，进行培育。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培育基表面形成单个菌落。1.微生物培育基主要含有碳源、氮源、水和无机盐四类物质。除此之外往往还需加入生长因子、调整pH等。加入琼脂则为固体培育基。加入抗生素可抑制细菌生长。2.培育基按作用（功能）分为：选择培育基和鉴别培育基；按物理属性分为：固体培育基和液体培育基。补充：液体培育基可用于快速扩增微生物；而纯化和计数必需用固体培育基。留意：获得纯净微生物的关键是无菌技术（防止杂菌污染）。3.培育基用高压蒸汽灭菌；接种环用灼烧灭菌；玻璃器皿用干热灭菌。4.用伊红美蓝培育基可鉴定大肠杆菌，菌落呈现黑色。5.微生物的纯化方法：平板划线法和稀释涂布平板法。纯化的目的：获得单菌落。6.菌落的概念：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。7.菌落的特征：形态、大小、隆起程度和颜色等，都可以用于鉴定菌种。8.微生物的计数方法：（1）显微镜干脆计数法（比实际值偏大）→因为死菌和活菌都统计了；（2）稀释涂布平板法（比实际值偏小）→因为两个或多个细胞连在一起时，平板上只能视察到一个菌落（单菌落）。9.稀释涂布平板法计数留意点：（1）计数时，每个稀释浓度一般涂布3个平板；（2）计数所用平板中的菌落在30～300之间；（3）计算统计的菌落数不肯定是活菌数；（4）统计值比实际值偏小，计算公式：eq\f(每个平板计数平均值,涂布时所用稀释液的体积)×稀释倍数单位：个/mL留意：该公式基于原液为1mL。若原液为1L中取了1mL进行梯度稀释，那么在总数上乘1000，单位为个/L。10.菌种的保存方法：临时保藏→用试管的固体斜面培育基接种后保藏在4℃冰箱中；长期保存→用甘油管藏法。1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？提示：平板正置时，平板冷凝后，皿盖上会凝聚水珠，将平板倒置，既可以避开培育基表面的水分挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培育基，造成污染。2.微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？提示：不是。微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等，其核心是防止杂菌污染，保证培育物的纯度。3.得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板肯定正确吗？提示：如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出缘由并重新进行试验。微生物培育试验中的常见的两种比照组与一种重复组的作用分别是什么？提示：（1）若将未接种的选择培育基与接种的选择培育基一起培育——用于确认培育基灭菌是否彻底（制备是否合格）。（2）若将接种的一般培育基与接种的选择培育基一起培育——用于确认选择培育基是否起到“筛选”作用。（3）进行微生物计数时，每一稀释度下涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数精确度。1.（2024·全国卷Ⅰ）某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。探讨人员依据下图所示流程从淤泥中分别得到能高效降解S的细菌菌株。试验过程中须要甲、乙两种培育基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。回答下列问题：（1）试验时，盛有水或培育基的摇瓶通常采纳的方法进行灭菌。乙培育基中的Y物质是。甲、乙培育基均属于培育基。（2）试验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释倍。（3）在步骤⑤的筛选过程中，发觉当培育基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其缘由可能是（答出1点即可）。（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要试验步骤_________________________________________________________________________。（5）上述试验中，甲、乙两种培育基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长供应4类养分物质，即。解析：（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培育基的摇瓶，乙为固体培育基，故须要加入Y琼脂；甲和乙培育基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培育基。（2）若要在每个平板上涂布100μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1000×100÷200＝1×104倍。（3）当培育基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培育基上，培育后进行计数。（5）甲和乙培育基均含有水、无机盐、碳源、氮源。答案：（1）高压蒸汽灭菌琼脂选择（2）104（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培育基上，培育后计数（5）水、碳源、氮源和无机盐2.（2024·江苏卷）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关探讨。请回答下列问题：（1）常规微生物试验中，下列物品及其灭菌方法错误的是（填编号）。编号①②③④物品培育基接种环培育皿涂布器灭菌方法高压蒸汽火焰灼烧干热臭氧（2）称取1.0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培育基上，其中10倍稀释的菌悬液培育后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌个。（3）为了进一步提高酵母菌产酶实力，对分别所得的菌株，采纳射线辐照进行育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以为唯一碳源的固体培育基上，培育一段时间后，依据菌落直径大小进行初筛，选择直径的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。（4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培育探讨，结果如图。据图分析，应选择菌株进行后续相关探讨，理由是________________________________________________________。解析：（1）培育基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培育皿一般通过干热灭菌，涂布器应当用酒精引燃灭菌；故①②③正确，错误的是④。（2）稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。依据题意，1.0g土壤样品转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培育基上，则稀释的倍数为1000倍，其中10倍稀释的菌悬液培育后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10000＝4.6×105个。（3）依据题意，欲提高酵母菌产酶实力，可对分别得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐射，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培育基，将辐射处理的酵母菌涂布在该固体培育基上，形成单菌落；产脂肪酶实力越强的酵母菌，分解利用脂肪的实力越强，菌落生长越好，一段时间后，依据菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。（4）据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关探讨可选择菌株B，缘由是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的实力强，净化效果更好。答案：（1）④（2）梯度稀释4.6×105（或460000）（3）诱变脂肪（或油脂）较大（4）B该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪实力强，净化效果好热点1微生物的试验室培育与无菌技术1.（2024·广州一模）现已知细菌的抑藻方式有干脆抑藻（细菌与藻细胞干脆接触）和间接抑藻（细菌分泌胞外抑藻物质）两种方式。探讨人员从养殖场簇新养殖废水中筛选出了一株对某有害水华藻具高效抑藻实力的菌株，大致过程如下：制备养殖废水稀释液→接种于固体培育基→细菌纯化培育→发酵液抑藻试验→筛选菌株。回答下列问题。（1）培育基中能同时供应碳源、氮源的成分是（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaCl”）。为避开由于微生物繁殖导致培育基，而不相宜运用，配制好的培育基要马上进行灭菌。（2）制备不同浓度的养殖废水稀释液时每次都要更换无菌移液管，缘由是________________________。（3）为探究该菌株的抑藻方式，将适量去除菌体的发酵液（甲组）、含菌体的发酵液（乙组）和无菌培育基（丙组）分别加入到有害水华藻液中，适量条件培育一段时间，统计有害水华藻的数量。若，表明该菌株能进行间接抑藻。（4）对该菌株的胞外物质进行透析，在截留分子量分别为1000Da、500Da和100Da（Da表示单位）的透析袋（作用与半透膜相像）透析后，发觉袋内物质抑藻实力分别是无、有和有。这表明提取出来的抑藻物质的分子量范围最可能是。解析：（1）在细菌培育时，培育基中能同时供应碳源、氮源的成分是蛋白胨。获得纯净的培育基是探讨和应用微生物的前提，为避开由于微生物繁殖导致培育基污染，操作者需用酒精擦拭双手消毒，对金属用具、玻璃器皿、培育基等要进行灭菌，其中，培育基只能用高压蒸汽灭菌。（2）制备不同浓度的养殖废水稀释液时须要运用移液管。洗净后的移液管内壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端内外的水吸干，每次运用时需更换无菌移液管，缘由是运用过的移液管中的残留液会变更所移取溶液的浓度，影响试验结果。（3）为探究该菌株的抑藻方式，自变量是抑藻物质，因变量是水华藻细胞数量。其中甲、乙两组加入的是含菌体的发酵液与水华藻细胞，为间接抑藻（细菌分泌胞外抑藻物质）；丙组加入的是无菌培育基与水华藻细胞，为空白比照。若该菌株能进行间接抑藻，则甲、乙两组水华藻细胞的数量均明显低于丙组。（4）从题干信息可知，用截留分子量为1000Da的透析袋对该菌株的胞外物质进行透析后，袋内物质无抑藻实力，说明菌株胞外物质可以透过截留分子量为1000Da的透析袋；用500Da和100Da的透析袋对该菌株的胞外物质进行透析后，袋内物质有抑藻实力，说明菌株胞外物质不能透过截留分子量为500Da和100Da的透析袋。这表明提取出来的抑藻物质的分子量范围最可能在500Da～1000Da之间。答案：（1）蛋白胨污染高压蒸汽（2）运用过的移液管中的残留液会影响结果（3）甲组和乙组的水华藻数量均明显低于丙组（4）大于500Da且小于1000Da（或“500Da～1000Da”）2.（2024·广东六校联考）海洋藻类上常附着有多种微生物，其中部分在生物医药和日用化工等生产领域具有重要的经济价值，而部分会产生某些毒素污染环境或毒害动物，人们须要对它们进行大量的探讨。请回答下列问题：（1）若要将微生物采纳平板划线法进行分别操作，正确的是图，其正确操作过程中，划线工具至少要灼烧次。（2）长期保存菌种时，应将培育的菌液与充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱保存，丢弃已经接种过微生物的培育基前，往往须要先行灭菌，以免_________________________________________________。（3）A、B两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数下每隔一段时间记录数据（统计时间内微生物总数在增长过程中），得到以下结果培育时间（小时）24487296A组菌落均值（个）18253632B组菌落均值（个）20283832计数时最好取72小时记录的菌落数作为试验结果，缘由是①_________________________________________；②_______________________________________。（4）发酵工程常常须要对某些微生物进行固定，最常用的方法是法。某真菌产生的油脂不易挥发，可选用（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。解析：（1）由分析可知：若要将微生物采纳平板划线法进行分别操作，图B是正确的，其正确操作过程中，由图中的划线区域共四个，取菌种前以及每次划线前和最终划线完毕都有灼烧，故划线工具至少要灼烧5次。（2）菌种长期保存的方法是甘油管藏法，故应将培育的菌液与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱保存，为了避开污染环境或者对其他生物产生毒害，丢弃已经接种过微生物的培育基前，往往须要先行灭菌。（3）为避开因为①培育时间不足，遗漏菌落数目，或培育时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落，影响计数的结果，故最好取72小时记录的菌落数作为试验结果。（4）对于细胞常常用包埋法进行固定，故对某些微生物进行固定，最常用的方法是包埋法。对于不易挥发的某真菌产生的油脂，可选用萃取法从菌体中提取。答案：（1）B5（2）甘油污染环境或者对其他生物产生毒害（3）①培育时间不足，遗漏菌落数目；②培育时间过长，两个或多个菌落连成一个菌落（两空位置可以互换）（4）包埋萃取法制备选择培育基的3个常用方法（1）在基本培育基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分别出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要养分成分完整的基础上进行的。（2）变更培育基中的养分成分。例如缺乏氮源时可以分别出固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分别出能消退石油污染的微生物。（3）变更微生物的培育条件。例如，将培育基放在高温环境下培育，可以得到耐高温的微生物。热点2综合考查微生物的培育、分别、计数及应用3.（2024·深圳一模）某生物爱好小组探讨从土壤中分别能够分解纤维素的微生物。回答下列问题。（1）分解纤维素的微生物将纤维素水解后氧化分解的最终产物是。（2）该小组将富含纤维素的土壤作为土样，加入至选择培育基中进行振荡培育，此阶段培育目的是。吸取上述培育液，稀释涂布到加入了（染料）的另一种培育基，以筛选出纤维素分解菌，并依据菌落周边所出现的大小初步推断纤维素分解菌分解实力的大小。（3）利用稀释涂布平板法测定细菌数时，每个稀释度至少涂布个平板。小组中甲同学在某稀释浓度下筛选出150个菌落，其他同学在该浓度下只筛选出大约50个菌落。乙同学分析甲的试验结果与其他同学差异的缘由可能是（答一项即可），为了验证这一分析，进一步试验的思路是__________________________________________________。解析：（1）分解纤维素的微生物将纤维素水解后得到葡萄糖，葡萄糖氧化分解的最终产物是二氧化碳和水。（2）振荡可以增加溶氧量及微生物与养分物质的接触，此阶段培育目的是增加所需微生物的的浓度（使目的微生物得到快速繁殖）。刚果红能与培育基中的纤维素形成红色复合物，吸取上述培育液，稀释涂布到加入了刚果红（染料）的另一种培育基，以筛选出纤维素分解菌。并依据菌落周边所出现透亮圈的大小初步推断纤维素分解菌分解实力的大小，直径越大，分解实力越强。（3）利用稀释涂布平板法测定细菌数时，每个稀释度至少涂布3个平板，以减小误差。甲的菌落数过多，可能是培育基被污染。为了验证这一分析，可以用甲同学配制的同批培育基在不加土样的状况下进行培育，作为空白比照或进行重复试验。答案：（1）二氧化碳和水（2）增加所需微生物的的浓度（使目的微生物得到快速繁殖）刚果红透亮圈（3）3①培育基被污染用甲同学配制的同批培育基在不加土样的状况下进行培育，作为空白比照（或②甲所选土壤样品不一样用与甲同学一样的土壤进行重复试验）4.（2024·南昌期末）为了分别和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的试验。（1）配制好的培育基灭菌通常可以运用法。步骤③与步骤②中培育基成分的最大区分是。（2）同学甲进行过程④的操作，其中一个平板经培育后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是；推想同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培育了一段时间，这样做的目的是。（3）同学乙也依据同学甲的接种方法进行了过程④的操作：将1mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液；经适当培育后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为。（4）步骤⑤须要震荡培育其目的是提高培育液溶氧量，同时使，提高养分物质利用率。（5）步骤⑤后取样测定石油含量的目的是__________________________________________________。解析：（1）依据题意，要分别和纯化高效分解石油的细菌，配制好的培育基灭菌通常可以运用高压蒸汽灭菌法。图中步骤②是扩大培育来自被石油污染过的土壤中细菌，步骤③是利用添加石油扩大培育分解石油的细菌，步骤③与步骤②中培育基成分的最大区分是步骤③的培育基中石油是唯一碳源。（2）过程④是对分解石油的细菌进行分别，分析B图可知，分解石油的细菌在培育基表面分布较为匀称，说明同学甲进行过程④的操作中接种方法是稀释涂布平板法；图B中培育基表面左侧的菌落数目明显比右侧多，推想同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是接种时涂布不匀称；在接种前需随机取若干灭菌后的空白平板先行培育了一段时间，这样做的目的是检测培育基平板灭菌是否合格。（3）同学乙也依据同学甲的接种方法进行了过程④的操作：将1mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液；经适当培育后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为（56＋58＋57）÷3÷0.1×100×1000＝5.7×107。（4）步骤⑤须要震荡培育其目的是提高培育液溶氧量，同时使菌体与培育液充分接触，提高养分物质利用率。（5）步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油实力最好的细菌，其中石油剩余量最少的一组所含的细菌就是分解石油实力最好的细菌。答案：（1）高压蒸汽灭菌石油是唯一碳源（2）稀释涂布平板法涂布不匀称检测培育基平板灭菌是否合格（3）5.7×107（4）菌体与培育液充分接触（5）筛选出分解石油实力最好的细菌5.（2024·陕西模拟）测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培育基（EMB培育基）上长出的菌落呈黑色。如图所示；滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培育基上培育→统计菌落数目。据图回答问题。（1）过滤待测水样须要用到滤杯、滤膜和滤瓶，其中须要经过灭菌处理的是。与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行。（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为__________________________________________________________________________________。（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培育基上，这属于微生物培育中的操作。从功能上看，EMB培育基属于培育基。（4）无菌操作下将90mL无菌水加入到10mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培育基上的菌落数为45，黑色菌落为5，则1升待测水样中的大肠杆菌数目为个。（5）若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径（填“更