分子诊断在感染性疾病中的应用(共61张课件)

分子诊断在感染性疾病中的应用第1页，共61页。感染的慨念

感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程.

病原体:细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫……

条件致病菌微生物人体微生物人体不同的感染状态共生状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生第2页，共61页。感染性疾病的分子诊断策略一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）：判断有无感染是何种病原体感染常用方法：PCR＋分子探针杂交完整性策略检出病原体分型（分类）－亚型－耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序第3页，共61页。分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等感染性疾病的分子诊断临床价值第4页，共61页。一、感染性疾病的诊断和治疗监测

（一）结核分枝杆菌（二）肝炎病毒

（三）人类免疫缺陷病毒（五）SARS冠状病毒（四）HPV病毒第5页，共61页。

感染方式呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病疾病种类多样化以肺结核为主结核分枝杆菌(M.tuberculosis)第6页，共61页。生物学主要特点：1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

第7页，共61页。实验室诊断现状第8页，共61页。分子生物学检测方法近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。第9页，共61页。现代分子生物学快速诊断基因结构分子诊断第10页，共61页。共价封闭环状结构标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因

基因组特点第11页，共61页。MDR早期诊断分枝杆菌分子诊断系统

菌种鉴定筛查、鉴别诊断实时荧光PCR基因芯片快速检测平台第12页，共61页。高效：一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM快速：4周（菌培）3小时灵敏：10个菌/反应（TB）；102

个菌/反应（NTM）13分枝杆菌核酸检测功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断第13页，共61页。高效：同时检测17种分枝杆菌（包括TB）快速：＞4周（菌种鉴定）6小时灵敏：

103

个菌/反应检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。14分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）

第14页，共61页。通量：两个一线抗结核药（MDR）速度：8周（药敏）6小时灵敏度：103

个菌/反应基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。15结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒第15页，共61页。病毒性疾病的分子检测第16页，共61页。乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,

HBV）全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者

世界其它地区亚太地区75%75%的长期慢性携带者来自亚太地区第17页，共61页。有许多因素影响着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等率为100%。(3)用型特异的引物对HCV核心基因巢式PCR。HCV基因型的筛选试验有：pre-CHBeAg人类免疫缺陷病毒

（HIV）现代分子生物学快速诊断SARS冠状病毒（SARSCoV）是一种新的变种的冠状病毒急性感染时期HBV的标志物应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。靶细胞：CD4+T细胞HCV分为6个主要基因型（Simmonds），HCV亚型已超过50个.其正链RNA分子大小为不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同LIPA方法tuberculosis)HBV的形态特征

DNA病毒双链（非环状）

DNA不等长正链（2/3）负链

最常见的血清型为adw、adr和ayw

亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内蒙古等地

第18页，共61页。HBV基因组结构

pre-S1pre-S1蛋白

pre-S2pre-S2蛋白

SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg编码HBsAgpre-S2pre-S1S区C区P区X区基因重叠第19页，共61页。急性感染时期HBV的标志物HBV检测窗口期血清学（HBsAg）：56天PCR：33天缩短23天（平均6-15天）第20页，共61页。HBV分子诊断方法扩增位置引物序列扩增片段大小(bp)P、X基因特异片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特异片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特异片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBV-DNA检测（PCR）PCR引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。部分常用的引物序列第21页，共61页。1．样本处理（样本处理区）2．核酸扩增2.1试剂配置（PCR前准备区）2.2加样（样本处理区）2.3PCR扩增（检测区）HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）试剂制备标本处理扩增检测xxx第22页，共61页。HBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）结果判断：FQ-PCR进行HBVDNA的定量检测，检测范围为2.5×102~2.5×109copies/ml

检测样本中5×102copies/ml≤HBVDNA≤5×107copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数检测样本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接报告为>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105-5×107copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正检测样本HBVDNA<5×10²copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检出限Ct值无数值时,报告为0.0copies/ml第23页，共61页。支链DNA（bDNA）技术

一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病毒的检测。第24页，共61页。还可以用于乙肝病毒基因检查的方法主要有：荧光PCR法、竞争PCR法、PCR酶联免疫吸附法、荧光标记物法和PCR酶联化学发光等方法。

第25页，共61页。变异株与耐药突变检测

HBV可能发生自然变异HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第26页，共61页。HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化第27页，共61页。第28页，共61页。第29页，共61页。第30页，共61页。第31页，共61页。46.91℃54.64℃50.74℃第32页，共61页。丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的临床诊断1.流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。2.临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。3.实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCVRNA阳性。约90%的输血后非甲非乙型肝炎和70

80%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致第33页，共61页。HCV-RNA定性试验引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化检测基因型方法一般分为二类：高效：同时检测17种分枝杆菌（包括TB）5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’人类免疫缺陷病毒

（HIV）传播途径：主要通过接触感染灵敏：10个菌/反应（TB）；包含4000个蛋白质编码基因中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者Step5:Translation检测样本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接报告为>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105-5×107copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正速度：8周（药敏）6小时基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同HCV血中HCV含量仅为HBV的千分之一HCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难HCV的变异性很高，使其诊断十分困难HCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体HCV分子诊断技术尤为重要第34页，共61页。HCV基因组（单链RNA）呈球形颗粒直径约50nm有一脂质包膜核心：单股正链RNA，全长9.4kb仅一个开放读框（ORF），编码一条含有3008

3037个氨基酸的病毒前体多肽第35页，共61页。pre-S2pre-S2蛋白有11个ORF，编码：依赖于RNA的RNA聚合酶（rep）、4种结构蛋白（S,E,M,N）、5种未知蛋白基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。ACD/EDTA/HEP现代分子生物学快速诊断nef（negativeregulatorfactor）痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、速度：8周（药敏）6小时分型（分类）－亚型－耐药性tat（trans-actingtranscriptionalgene）5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’-靶扩增技术如定量PCR方法近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。（三）人类免疫缺陷病毒HBV可能发生自然变异或者扩增另一个基因片段HCV基因分型的多样性由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性HCV分为6个主要基因型（Simmonds），HCV亚型已超过50个.HCVRNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案.第36页，共61页。HCV分子诊断HCV-RNA定性试验逆转录PCR有许多因素影响着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等严格的质控、操作人员的熟练程度尤为重要HCVRNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性即可确证HCV感染一次检测阴性不能完全排除HCV感染，应重复检查第37页，共61页。HCV-RNA定量试验

估价血清中HCV-RNA水平反映感染机体的病毒复制率及清除率在未治疗的慢性丙肝机体内病毒负荷相对稳定目前有二种方法可定量HCV-RNA水平

-靶扩增技术如定量PCR方法

-信号扩增技术如支链DNA法

第38页，共61页。HCVRNA定量（real-timeRT-PCR）质控标准阴性对照的检测结果为阴性强阳性对照的Ct值应小于等于30.0临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值否则此次实验视为无效结果判断Ct值无数值的样本为阴性样本Ct值≤36.0的样本为阳性Ct值大于36.0的样本建议重做，重做结果无数值者为阴性，否则为阳性第39页，共61页。HCVRNA定量结果表示方法HCVRNA定量检测法有两种表示方法：拷贝/ml（罗氏公司CobasV2.0）IU/ml（美国国立遗传学研究所的SuperQuant）两者之间可以进行换算，IU/ml与拷贝数/ml换算公式是：IU/ml=0.854

拷贝数/ml+0.538第40页，共61页。特别说明应注意HCVRNA检测中的假阳性和假阴性在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105～107拷贝/ml在慢性感染者中，HCVRNA水平变化范围在5×104～5×106拷贝/ml之间，同一患者血液中HCVRNA的水平相对稳定HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可以作为抗病毒治疗疗效评估的观察指标（“评估”和“预测”）

第41页，共61页。HCV基因型测定

检测基因型方法一般分为二类：

⑴检测HCV基因的点突变的筛选试验⑵评估HCV基因更大片段的验证性试验

HCV基因型的筛选试验有：

(1)对HCV高度保守的5’-NC区域行限制性片段长度多型性分析（RFLP）

(2)对HCV-5’NC区域行逆转录斑点杂交分析，又名

LIPA方法

(3)用型特异的引物对HCV核心基因巢式PCR。

(4)病毒蛋白抗原性分型评估HCV基因更大片段的验证性试验-----序列分析第42页，共61页。人类免疫缺陷病毒

（HIV

）第43页，共61页。全国累计报告HIV感染者地理分布1-100101-500501-10001001-50005001-10000>10000HIV感染者数截至2005年12月底第44页，共61页。HIV在宿主细胞中的复制Step1:BindingStep2:ReverseTranscriptionStep3:IntegrationStep4:ReplicationStep5:TranslationStep6:ViralAssembly靶细胞：CD4+T细胞第45页，共61页。HIV基因组基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同其正链RNA分子大小为

HIV-19.3kb有3组共8个基因

HIV-29.7kb有3组共9个基因5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构

第46页，共61页。HIV基因组第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序

gag（groupofantigen)基因：编码核心蛋白

pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶

env（envelop）基因：编码包膜蛋白LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性第二组：参与基因表达的调节基因

tat（trans-actingtranscriptionalgene）

rev（regulatorofexpressionofviralprotein）

nef（negativeregulatorfactor）第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因

vif（viralinfectivityfactor）

vpu（viralproteinU）

vpr（viralproteinR）第47页，共61页。HIV基因组遗传变异率高高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段HIV疫苗研发难度大第48页，共61页。HIV-1感染后病毒标志物的变化窗口期：检测抗体2-12周检测p24抗原2-3周检测RNA11天第49页，共61页。HCV分为6个主要基因型（Simmonds），HCV亚型已超过50个.HCV基因分型的多样性应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。变异株与耐药突变检测⑴检测HCV基因的点突变的筛选试验人类免疫缺陷病毒

（HIV）优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，HPV16型和18型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要原因Step2:ReverseTranscription结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同低危型：主要包括HPV6和HPV11HIV病毒载量（HIVRNA定量）主要有三种技术：RT-PCR（最低检测限为50copies/ml）bDNA（最低检测限为50copies/ml）NASBA（最低检测限为20copies/ml）NASBA（nucleicacidsequence-basedamplification）基于核酸等温扩增技术

方法检测范围实验内标准差（lg）抗凝剂RT-PCR4

102-5

0.15

0.33ACD/EDTAbDNA4

102-50.08

0.33EDTANASBA4

102-50.13

0.33ACD/EDTA/HEP第50页，共61页。病毒基因组是双链DNA.具有宿主和组织特异性：人是HPV惟一自然宿主传播途径：主要通过接触感染经性接触传播新生儿可经产道感染不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同HPV的免疫防御机制尚不十分清楚HPV的致癌潜力分为高危型：主要包括HPV16、18、31、33、45、35、39、51、52和58等（其中HPV16和HPV18与子宫颈癌发生密切相关）低危型：主要包括HPV6和HPV11人乳头状瘤病毒（HPV）第51页，共61页。《中国妇女人乳头状瘤病毒（HPV）感染和宫颈癌流行病学调查》大规模的人群专项调查发现：我国城乡妇女高危型HPV感染率均较高，并在20~24岁和40~44岁两个年龄段呈现感染高峰；以医院为基础、覆盖7个地区的调查显示：我国妇女83%的子宫颈浸润癌、84%的子宫颈鳞癌均有HPV16型或18型引起；HPV16型和18型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要原因HPV第52页，共61页。HPV检测实验室诊断分子生物学方法检测HPVDNA在诊断同时确定型别：如斑点杂交、原位杂交，DNA印迹法（此法为最可靠的方法）以HPV基因型特异性引物进行PCR扩增，再用特异性探针杂交法检测扩增产物（此法特异、敏感、被广泛采用）免疫印迹（Westernblot）检测病人血清中基因型特异性抗体第53页，共61页。SARS相关冠状病毒2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50例严重型急性呼吸道综合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的临床表现和病毒学研究结果。一种新的冠状病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。

(Lancet,2003,361:9365)第54页，共61页。SARS冠状病毒（SARScoronavirus）