生物技术-基因工程篇

生物技术之

——基因工程篇基因工程(geneticengineering)基因工程又称DNA重组技术，即在体外把两种或者两种以上不同来源的DNA分子重新组合成新的DNA分子，通过载体转入受体细胞内，将所需要的经过修饰的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或转基因生物。基因工程的基本步骤分离/制备目的基因选择载体使目标基因与载体DNA连接形成重组体以重组体转化宿主细胞（细菌或其他细胞）筛选出能够表达重组DNA的宿主细胞，使这些细胞扩增、繁殖获得大量拷贝的目的基因使目的基因在宿主细胞表达出编码的多肽基因工程（原核表达系统）操作的基本步骤一、目标基因的制备1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）2、酶促合成法/反向转录法3、人工合成法4、通过PCR把目的基因扩增出来1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）基因组文库（genomiclibrary）cDNA文库文库（cDNAlibrary）用合适的探针通过分子杂交，从基因库中分离出含有特定基因的克隆mRNAcDNA逆转录2、酶促合成法/反向转录法逆转录3、人工合成法蛋白质的氨基酸序列※用于结构清楚、分子量较小的基因核苷酸序列化学合成目的基因按密码子推算

利用化学合成法已成功合成人生长激素释放因子、胸腺素、血管升压素、胰岛素、α干扰素等基因，并进一步生产出相应的药物。4、通过PCR把目的基因扩增出来

外源目的DNA一般缺乏直接导入宿主细胞和进行DNA复制的能力，不能在宿主细胞表达，必须依赖适当的载体分子。二、载体的选择

载体（vector）：运载外源性DNA有效地进入到受体细胞内的工具。

1、

载体应具备的条件①是单个复制单元，能在宿主细胞内独立复制自身。②分子相对较小（3~10kb），以便从细胞中分离纯化。③含有多种限制性内切酶单一切点，酶切位点应在复制子以外适当的位置。④能接纳尽可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。⑤必须有便于筛选的明显标志，如耐药性和空斑形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出⑥对受体细胞无害。⑦有促进外源性DNA表达的调控区；

※天然载体有很多缺点，远远达不到理想载体的要求，通常使用的载体都是经过改造过的载体。质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒(vector)

2、载体的种类按来源分

克隆载体(cloningvector)按作用分表达载体(expressionvector)（1）质粒载体存在于细菌染色体之外的双链环状小型DNA分子。质粒的存在与否一般对细菌的生存没有决定性的影响。带有选择性遗传标志，如基因的产物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核细胞或真核细胞均可复制的穿梭质粒（shuttleplasmid）。

质粒在宿主细胞中的复制有两种类型严密型质粒：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个宿主细胞内只有1~5个严密型质粒。

松弛型质粒：复制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在没有蛋白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存有10~200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及染色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。

利用此原理可在质粒扩增时，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成，达到进一步扩增松弛型质粒的目的。

实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322,pUC19等。PBR322抗氨苄青基因抗四环素基因4363bp质粒携带外源基因1）λ噬菌体（2）噬菌体载体感染细菌的病毒a.λ噬菌体的基因结构特点•双链DNA分子（线性或环形），两端具有12个核苷酸组成的互补的粘性末端。当λ噬菌体感染宿主细胞后，双链线状DNA分子立即通过粘性末端互补连接，封闭成环。这个粘性末端结合的部位称为COS位点（cohesiveendsite）。•具非必需区/非生活区（中间区约1/3长度），此区可通过遗传工程技术由外源性的DNA所代替。b.λ噬菌体感染细菌后有两种生活途径

溶菌性

在细菌中连续增殖直到细菌裂解，释放噬菌体。

溶源性将其DNA整合入细菌基因组DNA中，与宿主DNA一起复制，然后传给子代，宿主细胞不发生裂解。只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。噬菌体的溶源周期和溶菌周期c.λ噬菌体作为基因克隆载体的几点好处•可在体外包装成病毒颗粒，可高效感染宿主细胞（大肠杆菌）•容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。•重组的λ噬菌体容易筛选，也容易保存。d.不利处λ噬菌体上有过多的限制性内切酶位点，因此必须对野生型λ噬菌体进行改造，除去基因组“生活区”的酶切位点，而有目的的在“非生活区”保留1～

2个酶切位点，以满足构建重组载体的需要。e.经过改造构建后的λ噬菌体载体有两类

插入型载体：只有一个限制性内切酶位点可供插入外源性DNA片段。替代型载体：含有某个限制性内切酶的两个切点，这两个切点间的片段可以被外源性DNA替代。2）M13噬菌体（M13phage）a.M13噬菌体基因的结构及生活史特点单链线性DNA分子，长约6500个核苷酸；感染大肠杆菌后，单链线性DNA分子可转变成双链复制型(RF)。从大肠杆菌中分离出双链复制型的M13还可作为克隆双链DNA的载体；大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢，而新的噬菌体被释放到菌体外。基因组中有一段长约507个核苷酸的非必需区(IS)，可以插入外源性DNA。b.M13噬菌体作为基因克隆载体的优点从宿主菌体中释放出来的M13噬菌体粒子只含单链DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中两条中的一条，因此可用来制备单链DNA探针，也可以用作DNA测序的模板。c.对M13噬菌体的改造

野生型M13噬菌体的非必需区中没有常用内切酶的切割位点。因此，用作载体的M13均是经过一系列改造后而构建的，如M13mp2、mp5、mp7、mp9、mp18、mp19。

具体的改造方法是在野生型M13DNA中人工插入两个核苷酸顺序：

大肠杆菌乳糖操纵子中的控制区和β-半乳糖苷酶基因（Z基因）。

如果在培养基中加入诱导物异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（x-gal，为一种色原），由IPTG诱导而产生的β-半乳糖苷酶可以使x-gal水解，产生蓝色化合物/蓝色噬菌斑。

插入50bp长的一小段DNA顺序，称为多接头（polylinker）。在这个接头中约有10多种内切酶割切位点。由于多接头区位于β-半乳糖苷酶基因中，所以，当外源性DNA片段克隆到多接头处任何一个切割位点，被转化的大肠杆菌就不能产生β-半乳糖苷酶，从而在含有IPTG和x-gal的培养基中产生无色噬菌斑。

是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。

由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。

在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。（3）粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒/粘粒/cos质粒cosmid的构造特点:

含有抗药标志和复制起始部位；

一个或多个单一酶的限制位点；

带有入噬菌体粘性末端；

分子小，可容纳大的外源DNA片段。将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列（ARS）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞YAC。1）酵母为宿主的载体（4）真核细胞为宿主的克隆载体人工构建的酵母质粒

酵母人工微小染色体（YAC）2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体Ti质粒是根瘤土壤杆菌内的质粒，对其改造可构建成在植物细胞克隆或表达的载体。3）DNA病毒载体——理想的动物细胞基因工程载体SV40载体（猴肾病毒）完整的SV40载体利用SV40元件组建的穿梭质粒载体，如pSVK3质粒：由噬菌体三种载体构建而成质粒SV40乳头瘤病毒载体

如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。腺病毒载体

克隆载体(cloningvector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。

表达载体(expressionvector)在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体,除克隆载体的特性外还含有启动子、核糖体结合位点、转录终止信号等。三、目标基因与载体DNA连接形成重组体

工具酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷酸酯键，切断分子,水解磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3′端为—OH。

识别序列的特点

①专一；②常由4~6个碱基组成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-

限制性内切酶都是从原核生物中发现的。到目前为止已发现上千种限制性内切酶，其中数十种被经常使用。限制酶的命名

EcoRⅠ细菌的属名从该细菌中分离出的第几个酶细菌种名细菌株系切口类型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCCDNA连接酶(DNAligase)目的基因受体细胞

大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞※受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，使载体或重组DNA不被水解四、重组DNA导入受体细胞

细菌细胞作为表达系统

优点：操作简单、增代时间短、价格低廉；

某些蛋白质的表达水平很高

缺点:表达多肽分子常不能适当地折叠,蛋白质常无生物活性；

异体蛋白质，常对细菌有毒性作用；

缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如使蛋白质磷酸化、糖基化

1、化学转化法

受体细胞经一定的化学作用后，细胞膜通透性增加，处于感受态，称之为感受态细胞（Competentcells）。Cacl2法：受体菌（如大肠杆菌

E-coli）在低温下（0℃）被置于低渗的Cacl2溶液中，菌体膨胀成球形。转化体系中的DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，之后细菌经42℃短时间热冲击处理，此时受体菌可大量吸收其表面粘附的DNA复合物，完成转化，继而在培养基上生长一定时间（数小时）后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。2、物理转化法电穿孔法把受体细胞悬浮到含有转移DNA的的平衡液中，加上瞬间高压脉冲电，使细胞膜和核膜的通透性改变，一些DNA分子可以进入受体核内而被表达。微量注射法用微玻璃管通过显微操作直接把纯化的DNA注入到受体细胞内。3、转染用噬菌体或真核生物的病毒作为载体转化细胞常成为转染。4、电泳、双酶切、测序验证五、筛选出能够表达重组DNA的宿主细胞1、根据载体抗生素抗性基因筛选转化子