鼠疫耶尔森菌实验活动风险评估报告

2.文本格式：宋体，五号，行距固定值18。文中各序号标题为黑体，五号。第七节鼠疫耶尔森菌实验活动风险评估报告生物因子鼠疫耶尔森菌（Yersiniapestis）是烈性传染病鼠疫的病原体，其别名与检索为鼠疫杆菌（Bacilluspestis）或鼠疫菌，鼠疫耶尔森菌在《人间传染的病原微生物名录》中危害程度分类为第二类的病原微生物。一般特性1.形态特征鼠疫菌为革兰氏染色阴性、两端钝圆、两极浓染的短小杆菌，菌体长为1.0~2.0μm，宽0.5~0.7μm，有荚膜，无鞭毛，无芽孢。2.培养特性鼠疫菌为兼性厌氧菌，通常使用赫氏消化液溶血培养基进行分离培养，其最适宜的培养温度为28~30℃。通常，在光学显微镜下观察，鼠疫菌落中央呈黄褐色，有粗糙颗粒，呈小丘状突起，边缘薄而透明、有锯齿状花边。鼠疫菌可以酵解多种糖类，产酸不产气。3.免疫学特性鼠疫菌含有18种抗原成分，其中FI抗原为鼠疫菌的特异性和保护性抗原。它是一种糖蛋白，其编码基因（caƒ1）位于鼠疫菌的pMT1质粒上，在37℃时能够获得最大量的表达。人类对鼠疫普遍易感，而及时治疗则可以完全治愈，愈后可保持较为持久的免疫力。4.遗传特性鼠疫菌基因由一条环状染色体（约4.6~4.7Mb）和三个质粒（pPCP1、pCD1、pMT1）组成，含有4000多个编码序列。其基因组最明显的特征是散布着大量的插入序列和各种类型的重复序列，基因组重拍频繁，并具有高度的流动性。5.种（型）鉴别特征鼠疫菌仅有一个血清型和噬菌体型。我国根据鼠疫自然疫源地的地理、宿主、媒介及病原体的生物学特征将其分为18个生态型，它们分布于我国不同类型的鼠疫自然疫源地。目前，通过采用DFRs、SNP、IS、MLVA、PFGE等分子生物学方法，可以获得我国不同疫源地鼠疫菌之间的遗传学差异特征。（二）来源鼠疫是一种自然疫源性疾病。由于世界各地存在许多自然疫源地，我国也发现有11个类别的鼠疫自然疫源地，因此，野鼠鼠疫将长期持续存在。浙江省属于我国11个类别鼠疫自然疫源地之一的南方黄胸鼠家鼠鼠疫自然疫源地，但自1954年起未再发生过人间和动物间鼠疫的流行。人间鼠疫的流行，通常是直接在鼠疫自然疫源地中因接触染疫动物或蚤类而造成的散发或暴发流行。大流行多见于家鼠间的鼠疫动物病和人与人间的直接接触传播。在不同的地区，由于鼠疫宿主的不同，鼠疫的流行存在地区性、季节性和周期性。同时，鼠疫流行还受自然和社会等因素的影响。鼠疫菌是最早被使用的生物战剂之一。在抗日战争中，日军曾使用过这种生物战剂，并造成我国某些地区为鼠疫疫源地。我省宁波、衢州、义乌等地的鼠疫疫源地，就是由于1940—1948年间，日军将鼠疫菌作为细菌战剂而人为造成的“植入型”疫源地。1984年，耶尔森和北里柴三郎首次从香港的鼠疫死亡病例体内分离到鼠疫菌。2004年第二版《伯杰氏分类细菌学手册》将鼠疫菌分类为细菌域（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、耶尔森菌属（Yersinia）、鼠疫耶尔森菌种（Yersiniapestis）。（三）传染性鼠疫是一种自然疫源性疾病，主要发生在鼠疫自然疫源地的啮齿类动物之间。目前，世界上已发现有300多种脊椎动物可以自然感染鼠疫，其中最主要的传染源为啮齿类动物、兔形目动物。这些动物也是鼠疫菌的储存宿主。其他如猫、羊、兔、骆驼、狼、狐等也可能成为本病的传染源。我国已发现有87种染疫动物，其中啮齿类53种、兔形目5种、食虫类5种、食肉类12种、偶蹄目9种、鸟类3种。腺鼠疫病人在未形成败血症时，除非淋巴结破溃，否则病原体不能排出体外，故不能起到传染源作用。而肺鼠疫病人则是人间鼠疫的重要传染源。（四）传播途径自然感染途径鼠疫的传播途径主要有三种：媒介蚤类叮咬；空气传播；接触传播，即人类接触染疫动物被其寄生蚤叮咬而感染鼠疫。肺鼠疫患者呼吸道分泌物种含有大量鼠疫菌，通过呼吸、咳嗽时将鼠疫菌排入周围空气中，形成细菌微粒及气溶胶，可以造成周围人群的肺鼠疫流行。人类通过猎捕、宰杀、剥皮及食肉等方式直接接触疫染动物时，鼠疫菌可以通过手或上肢的微小创口直接进入，或人取食未充分煮熟的染疫兽肉而感染。非自然感染途径鼠疫实验室人员由于防护不严、操作不当和实验室事故，可通过吸入、锐器刺伤等途径感染鼠疫。在临床就诊时，未及时发现和诊断肺鼠疫病人，未采取防护措施，也可能造成陪护人员或医务人员的直接感染。（五）易感性人类对鼠疫普遍易感，没有天然免疫力。人类在流行病学上表现出差异与接触传染源的机会和频次有关。鼠疫流行有明显的季节性，与鼠疫自然疫源地的地理条件、宿主动物及其媒介蚤类的生态学特征有密切关系。通常，动物间鼠疫发生在前，人类鼠疫流行在后，而且基本上是在鼠疫自然疫源地内发生的。（六）潜伏期鼠疫的潜伏期很短，多数为2~3d，个别病例可达到9d。（七）剂量—效应关系鼠疫菌属于高致病性微生物，含有4种毒力因子（F1，VW，Pst，Pgm）。不同鼠疫自然疫源地来源的鼠疫菌毒力也不完全相同。在实验动物中，无论何种品系的小白鼠对鼠疫菌均敏感。用强毒菌皮下接种小鼠的LD50在1~104cfu范围内，而在大量感染的情况下，病程进展极快，发病后数小时即可导致死亡。其中，我国青藏高原型鼠疫菌皮下接种藏系绵羊的系数为3.5×102，静脉接种3.9×103可以导致藏系绵羊迅速发病及死亡。（八）致病性鼠疫菌侵入人体之后，临床主要表现为全身中毒症状，并在心血管、淋巴系统和实质性脏器出现特有的出血性炎症及脂肪变性。当人类被携带鼠疫菌的跳蚤叮咬后，通常叮咬的局部无明显痕迹，鼠疫菌则沿着局部的淋巴管流向所属的淋巴结，并在其中繁殖，引起淋巴结炎。感染的腺体极度肿胀，充血坏死，鼠疫菌可冲破局部的淋巴屏障，继续沿着淋巴系统扩散，转移到其他淋巴结。同时，鼠疫菌由淋巴结进入血循环，引起败血症和继发性鼠疫肺炎（肺鼠疫）。原发性肺鼠疫是经呼吸道飞沫传播而发病，肺泡及支气管内有含有鼠疫菌的血性渗出物，肺门淋巴结有肿胀、充血及出血。（九）变异性不同鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的编码序列、重复序列和插入序列均存在着一定的差异。受插入序列的影响，鼠疫菌基因组可以频繁出血重排、倒置和移位；同时，也可以明确改变其生化表性特征，包括对各种糖类的酵解和代谢能力。（十）稳定性（1）鼠疫菌在自然环境中不稳定，不形成芽孢。它在有变形菌、大肠杆菌和其他腐败菌繁殖的材料中很快死亡。鼠疫菌对寒冷的抵抗力较强，在-30℃时仍然可以存活。（2）鼠疫菌对化学消毒剂敏感，含氯消毒剂和甲醛都有良好的消毒作用，用量和时间与其他敏感细菌无异。同时，75%乙醇、常规紫外线照射也具有直接的杀灭作用。（3）含有鼠疫菌的培养物或污染物品，经20min高压灭菌后可以完全被杀灭。（十一）预防和治疗（1）在疫源地内避免直接接触不明原因的病死动物；在疫区做好个人防护，避免接触有临床症状的病人（尤其是肺鼠疫病人）或疑似病人，避免被蚤类叮咬；实验室人员在开展相应的检测工作时，做好个人防护并严格遵守操作规程。按照上述要求完全可以避免感染鼠疫。（2）我国目前使用的鼠疫疫苗是EV活疫苗。这种疫苗对鼠疫有一定的预防保护作用，可以减缓疾病过程，为治疗争取时间。但这种疫苗有以下缺点：①接种疫苗后仍可能发病；②对感染肺鼠疫的患者没有保护作用；③保护时间较短而需要多次接种；④免疫产生的抗体与感染无法区分。因此，在我国的鼠疫防治规定中已经取消了接种疫苗的要求。根据浙江省已有60多年未发生鼠疫的实际情况，决定本实验室所有工作人员暂不进行鼠疫疫苗的接种。当发生实验室意外、有感染危险时，拟采用投药方式进行预防。（3）治疗参照中华人民共和国原卫生部于2011年1月28日发布的《鼠疫诊疗方案（试行）》。首选链霉素，推荐剂量为第1日肌肉注射链霉素4~6g/d，首次2.0g肌肉注射，以后每4~6h肌肉注射0.5~1.0克/次。对于不能使用链霉素者，可换用环丙沙星，使用常规治疗剂量的2倍。对于有严重疾病表现者，加用强心和利尿剂，以缓解鼠疫菌释放的毒素对心、肾功能的影响。治疗可在排除鼠疫诊断时停止，如诊断成立，则直到体温恢复正常，实验室检查阴性，酌减低剂量继续用药3d。采取以上措施后，可阻止受到意外感染的人员感染他人。到目前为止，在我国还没有发现耐药菌株。在发生严重感染危险时，使用链霉素、环丙沙星等；一般感染危险可使用复方新诺明（SMZ）。使用一般细菌感染的常规治疗剂量，有较为可靠的阻断发病的效果。（十二）事故分析（1）实验室本身事故：本中心的BSL-2及BSL-3实验室中尚未发生过鼠疫耶尔森菌事故，目前也无野生的鼠疫菌株。（2）国内外相关实验室有在实验室内操作鼠疫菌感染人的事例。（3）理论上，重组DNA技术可以把鼠疫菌的毒力因子转移到其他细菌中，也可以在鼠疫菌中引入其他致病菌的毒力因子，从而产生出新的具有不同病原菌性质的致病菌，可能会改变菌株原有的侵袭力、侵袭途径、致病力等，因而可能会扩大原有的宿主范围。但这种操作具有较高的难度和技术要求，目前也尚未见到相关报道。风险评估与风险控制(一)实验活动1.实验活动内容及所操作病原微生物的浓度（1）一般操作的浓度和剂量。对鼠疫菌进行涂片、分离培养等常规操作时，标本常为污染的组织、血液、痰液、皮肤渗出物、血清等。这些标本中不含或仅含有极少量的鼠疫菌，因此在BSL-2实验室中即可进行，采取适当的防护措施，一般不会引起污染或感染。（2）标本浓缩操作的浓度和剂量。当需要对鼠疫菌进行质粒或染色体DNA提取、或蛋白质提取、菌株保存等需要细菌量较大时，一般操作使用的细菌浓度在109~1010以下，通常少于1mL。针对这些操作，应在BSL-3实验室中进行。2.鼠疫菌分离培养实验操作过程（以下过程应在相应等级实验室的生物安全柜中进行）（1）操作过程。对于新鲜材料（如血液、淋巴液、痰、脓液、菌种）可用接种环直接取材，涂于赫氏消化液培养基上，按三段法划线。污染或腐败材料接种于(1：20万~1：10万)龙胆紫赫氏消化液溶血培养基，均置28℃温箱培养。在24~96h内每日观察，发现具有鼠疫菌典型形态的菌落，及时挑取可疑单个菌落进行纯分离，或进行鼠疫噬菌体裂解试验。已接种的培养基需连续培养观察7d，确认无疑似鼠疫菌落出现时，并详细记录结果后，方可经高压灭菌后处理。（2）风险因素及控制措施（见表8-26）表8-26细菌分离培养过程中的风险因素及控制措施潜在风险因素发生可能性后果严重性控制措施残余风险细菌培养接种环接种时易发生滴落、污染平皿外部或手部中度1.本项操作应在生物安全柜内进行2.使用接种环接种时，要注意避免粘取的液体材料过多，而发生滴落现象3.接种环不能接触平皿外部，当污染平皿外部或手部时，要立即用75%乙醇擦拭污染部位，并更换外层手套低(二)实验室设施设备1.实验室设施BSL-3实验室内部为负压环境，可以防止出现意外事故时细菌随人员出入扩散到实验室外部的情况发生。BSL-3实验室的高校过滤器应定期更换和检测，可防止因滤器损坏造成细菌扩散。凡涉及病原、送检样品装入、取出、开包装等操作，均在BSL-3实验室的生物安全柜内进行。定期作无菌试验，检查BSL-3实验室微生物操作安全状况，及时发现实验室内部，包括生物安全柜台面、工作台面、地面、仪器表面等是否有病原菌的污染，并采取消毒措施。实验室实行终末消毒制度。2.仪器设备实验中主要使用的仪器设备包括生物安全柜、培养箱、离心机、高压灭菌器、移液器等。仪器设备的风险因素见表8-27。表8-27实验室仪器设备风险因素及控制措施仪器名称潜在风险发生可能性后果严重性控制措施残留风险生物安全柜由于操作时快速移动手臂，容易出现紊流或横向气流可能低度操作时动作要缓慢，双手尽可能避免横向移动。在开展实验之前，进行相关技术操作培训。定期维护设备低离心机离心管破裂，或内容物超过2/3刻度，导致样品溢洒可能高度采用合格的产品，离心管内容物不应超过2/3刻度，进行相关技术操作培训低培养箱电源短路；培养物污染外表面可能性低人员接触污染严格规范操作，定期检查低高压灭菌器人员接触高温部位，发生烫伤可能性中等人员发生烫伤操作培训，做好个人防护低移液器样品溢洒可能中度操作时铺垫消毒毛巾，进行相关技术操作培训低(三)人员1.实验室人员素质浙江省疾病预防控制中心现有从事鼠疫实验室检测工作的专业人员5人，均为高级职称。所有人员均接受过微生物操作技术与实验室安全的系统培训，并经考核合格确认适合现岗位工作，签署知情同意书。2.生物安全及专业技术培训实验室根据本部门当前及将来业务开展需要，组织制订人员培训计划。在常规微生物操作技术培训的基础上，还应进行消防和预备状态、化学品安全、生物危险和传染预防、救治、紧急医学处理措施的培训。所有工作人员均应熟悉病原微生物污染或割、刺伤等意外情况时所应采取的处理措施，并通过理论和实际操作考核评估每个工作人员对提供的信息的理解力。实验室对所有新进入实验室工作的各类人员进行上岗前安全知识培训和考核，考核结果作为上岗必备条件之一。实验室负责人从事高致病微生物工作多年，参加过多次现场疫情处理和各种实验室工作，曾在国家级相应的微生物研究所接受过专门培训，熟悉鼠疫菌操作工作中易于发生风险的各个环节，并有处理紧急事故的经验。3.健康监测和健康状况评估实验室工作人员每年参加体检，预留本底血清标本。实验室工作人员均应做链霉素敏感试验，试验阳性者不适宜从事鼠疫防止工作，需要调换其他工作岗位。4.实验室准入制度进入BSL-3实验区须凭指纹，须得到相关部门和实验室负责人的批准，应详细登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入。人员风险及控制措施（见表8-28）表8-28人员风险及控制措施潜在风险因素发生可能性后果严重性控制措施实验人员技术水平技术培训不足或操作不熟练导致误操作严重实验人员需接受相关技术培训并考核合格后方能上岗；定期进行相关培训及演练人员健康水平实验人员身体状况不佳或患有基础疾病中实验室工作人员每年参加体检，预留本底血清标本；实验人员进入BSL-3实验室前需测量体温，体温高于37℃者不能进入未经授权人员未经授权人员进入BSL-3实验室严重进入BSL-3实验室须得到相关部门和实验室负责人的批准，应详细登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入。(四)感染性材料1.感染性材料的运输鼠疫为法定管理的甲类传染病。因此，感染性材料和菌种管理实行双人双锁共同负责制，管理人员经BSL-3实验室培训合格获得上岗证后方能上岗。菌种管理实行全程控制（包括自动监控和影像监控），包括样品接收、菌种鉴定、包装、运输、登记、使用、保存、销毁等环节。离开实验室的细菌衍生株、细菌成分，以及不能高压灭菌的物品要规定严格的处理和检验程序。鼠疫菌的分离和培养方法成熟，可保证检出标本中少至1个活菌。只要保证足够的抽样比例，就可以保证离开实验室的标本与细菌成分的安全性。感染性材料运输过程中风险因素及控制措施（见表8-29）表8-29感染性材料运输过程中的风险因素及控制措施过程潜在风险现有风险控制措施改进措施常规操作误用、盗用、恶意使用接收菌种管自然破裂、溢出等/凡涉及病原、送检样品装入、取出、开包装等操作，都应在BSL-3的生物安全柜内进行，操作结束后及时消毒严格按照管理规定操作使用鼠疫菌DNA提取/按照样品比例10%抽样作无菌实验，连续观察7d，确认无鼠疫菌生长，消毒外包装，方可拿出实验室严格按照管理规定操作运输按要求包装并通过民航运输包装不符合，用公共交通工具运输样品或菌种3层包装，按照相关规定使用专车或民航运输严格按照管理规定内部转运实验室之间的转运平皿或试管滑落，样品包装不符要求样品和菌种经3层包装，使用带盖容器放入样品转运箱内进行内部转运严格按照管理规定操作保存保存于菌毒种库阶段工作结束后，未及时销毁培养物工作结束时，及时销毁培养物，保存菌种送菌毒种保存库，菌毒种保存库实行双人双锁，自动监控和影像全程监控严格按照管理规定操作（五）个人防护用品风险因素及控制措施（1）防护装备的防护部位主要包括眼睛、头面部、躯体、手、足，以及呼吸道。其装备包括护目镜、N95口罩、一次性帽子、防护服（棉布分体服、连体防护服）、乳胶手套、塑料手套、实验室专用鞋、鞋套等。（2）个人防护用品应符合国家规定的相关技术标准，使用前应仔细检查，不使用标志不清、过期、破损的防护用品。（3）在风险评估的基础上，按不同级别的防护要求选择适当的个人防护装备及类型。（4）工作人员要充分了解其实验工作的性质和特点，并正确使用个人防护装备。（六）消毒方法选择与感染性废弃物处理的风险因素及控制措施（1）实验室所选择的消毒剂为0.5%次氯酸钠，其应在使用时配置，并填写配置记录。75%乙醇的使用范围为皮肤消毒和工作台面、仪器设备消毒。（2）实验中产生的感染性废物应放在装废液的容器内，经次氯酸钠消毒液作用一定时间后，再进行高压灭菌处理。高压灭菌处理后的感染性废物将放入带有特殊标识的袋子，记录后转交给指定的医疗垃圾处理部门。（七）实验室意外事故风险及处理（1）常规意外。如水、电、火的意外处理按照BSL-3实验室《安全手册》的规定和应急措施进行处理，如使用双路电源，以备电力中断时使用；夜间及非工作时间应安排人员值班，检查仪器及实验室用电情况。（2）特殊意外。在微生物操作过程中出现的意外事故，例如皮肤损伤、离心管破裂、菌液溢洒等，应按照所制订的应急处理预案进行处理。BSL-3实验室应定期对实验室工作人员进行培训，并组织相应的应急演练。（3）BSL-3实验室对所有样本及菌种的保管，采用双人双锁、全程监控，以防止发生泄露或被盗。三、综合评估结论（1）原卫生部《人间传染的病原微生物名录》中，鼠疫菌被列为生物危害第二类的高致病性病原微生物。鼠疫菌能够通过呼吸道传播，链霉素为鼠疫治疗的特效抗生素。（2）按照《人间传染的病原微生物名录》规定，从监测现场采集的