脂质体脂膜结构的测定 x射线小角散射检测法

Q/LB.□XXXXX-XXXXT/SASXXXX—XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中国科学院上海高等研究院提出。本文件由上海市标准化协会归口。本文件起草单位：中国科学院上海高等研究院，上海交通大学、中国科学院长春应用化学研究所、上海师范大学、西南科技大学、中石化（北京）化工研究院有限公司、国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量监测与评价重点实验室、上海药品评审核查中心、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司、花安堂生物科技集团有限公司。本文件主要起草人：李怡雯、李娜、刘广峰、宋攀奇、张建桥、李秀宏、滑文强、魏晓慧、门永锋、邹爱华、田强、唐毓婧、陆家海、叶宇翔、周一萌、宋良益、程薇、卢永杰。本文件首期承诺执行单位：上海交通大学、中国科学院长春应用化学研究所、上海师范大学、西南科技大学、中石化（北京）化工研究院有限公司、国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量监测与评价重点实验室、上海药品评审核查中心、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司、花安堂生物科技集团有限公司。脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法范围本文件规定了利用X射线小角散射技术测定脂质体的脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布的方法。本文件适用于脂膜特征结构在纳米尺寸范围内的各向同性的稀疏样品体系，主要包括包载药物等成分的脂质体溶液样品。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T13221纳米粉末粒度分布的测定X射线小角散射法GB/T38944无损检测中子小角散射检测方法ISO17867粒度分析-X射线小角散射方法(Particlesizeanalysis-SmallangleX-rayscattering(SAXS))ISO20804X射线小角散射方法测量多孔及颗粒体系内比表面积(Determinationofthespecificsurfaceareaofporousandparticulatesystemsbysmall-angleX-rayscattering)ISO23484X射线小角散射方法测量粒子浓度(Determinationofparticleconcentrationbysmall-angleX-rayscattering)ISO26824颗粒体系的粒子表征-术语(Particlecharacterizationofparticulatesystems–Vocabulary)术语和定义ISO26824界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1脂质体liposome由脂质双分子层形成的微小囊泡。3.2稀疏体系dilutesystem所包含的待测粒子浓度低，粒子间相互作用可以忽略不计的体系。符号本文件使用的符号如表1所示。表1符号含义及单位符号含义单位q散射矢量的大小nm-1I(q)散射强度-T透射率-P(q)形状因子-F(q)散射振幅-ρ(z)电子密度分布-方法原理X射线小角散射是由样品中电子密度不均匀性分布所引起的、位于入射X射线束附近（通常小于5°）的散射现象。对于溶液样品而言，其散射图像源于X射线照射到的所有溶剂和溶质分子散射信号的叠加。因此，为得到脂质体粒子的散射强度，需从总散射强度中扣除溶剂等本底散射强度。在稀疏样品体系中，粒子间的相互作用忽略不计，脂质体粒子的散射强度直接反映了其内部结构特征。因此，可以通过结构模型拟合计算得到脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度和分布等参数。试样的制备和要求浓度要求脂质体样品浓度过低会导致散射信号太弱，而浓度过高可涉及粒子间的相互作用，影响数据分析。样品制备时宜通过建立浓度梯度确定散射强度与浓度的依赖关系。分散性要求样品制备宜保证其均一性或单分散性，如采用特定孔径的聚碳酸酯膜挤出。辅助性测试要求宜结合动态光散射、透射电镜等表征技术确定样品的尺寸、形貌等基本特征，辅助X射线小角散射技术进行结构模型的建立。对于包载药物等成分的脂质体样品，宜同时制备其未包载的空白脂质体作为检测对照组。检测系统和装置检测系统X射线小角散射检测系统应包括光源、准直系统、真空系统、样品台、探测器等，可选用实验室X射线小角散射仪或同步辐射X射线小角散射线站进行检测。前者通常采用金属靶产生X射线，后者则依托更高强度的同步辐射X射线光源。样品池装置样品池应满足X射线散射的光路要求，如自身不能产生明显的散射信号、X射线透过率高等。通常可以将样品注入薄壁毛细管（如外径为1mm，壁厚为0.01mm的石英玻璃毛细管）内进行检测。宜选择便于重复使用的样品池装置，以避免因样品池间差异所造成的本底散射扣减的不准确。检测区间及校正在检测之前，应根据脂质体脂膜结构的尺寸范围对所需的散射矢量区间按照公式（1）进行估算， q=2πd (式中：d——样品的目标结构尺寸，单位为纳米（nm）。估算出所需要的散射矢量检测区间后，即可在一定的入射X射线波长条件下，通过改变样品到探测器距离来调节实际的检测范围。应选择校准样品（如山嵛酸银粉末）对当前检测条件下的散射矢量进行标定。检测步骤步骤一将样品池装置固定在样品台上，调整样品池中心与X射线光路位置一致。步骤二将样品注入样品池中。根据样品对X射线的吸收情况以及散射信号接收探测器的灵敏度和饱和度，选择合理的曝光时间。若采用同步辐射X射线光源测试，曝光时间宜设置为1s～100s；采用金属靶X射线源测试，曝光时间宜设置为30min～60min。步骤三开始测试样品，保存及记录样品的散射图像以及光强度计数。应进行多次曝光测试，取平均值以提高散射数据信噪比。步骤四清洗样品池后，将与样品相匹配的缓冲溶剂注入样品池中。测试过程中的光路状态、曝光时间等应与样品的测试条件保持一致。步骤五清洗样品池后，从步骤二开始测试下一个样品。检测数据分析步骤一利用软件标出探测器损坏及无效的像素单元（例如不能正常感光、束流阻挡器位置处的像素单元等），并在后续计算过程中忽略该单元的数据。步骤二脂质体溶液样品为各向同性体系，无需选取特定方向，全探测器的数据均可用于径向平均转化为一维散射强度数据。注：绝对散射强度校正非本标准数据分析必要步骤，如有需要，可参考ISO20804-2022执行。步骤三按公式（2）对样品吸收、本底进行校正，得到修正后的散射强度， Imeasq=Isq式中：Imeasq——实验测得的IsqIbqTsTb透射率由光强度计数比值计算而得。步骤四宜根据检测样品的脂膜特征信息（如双分子层层数等），选择合适的结构模型以及尺寸分布函数进行散射强度曲线拟合。注：附录A示出了一种脂膜多层结构模型及其表达式。步骤五基于公式（3）进行优化搜索，定量解析出脂质体的脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度等参数。简化的卡方值χr2 χr2=1N−式中：Imeasq——通过公式（2）修正后的散射强度；ImodelqN——数据点个数；M——拟合参数个数；∆Ii——数据点的索引。检测数据分析结果拟合结果的曲线表示宜采用实验散射强度与模型拟合散射强度的对比关系图表达，横坐标为散射矢量，纵坐标为散射强度，如图1所示。图1实验散射强度与模型拟合散射强度对比相关参数表示可根据需要，采取表格形式展示拟合参数、结构参数等。误差分析主要包含散射强度数据转化时的统计误差、数据处理过程中的误差传递等。检测报告检测报告应至少包括以下内容：仪器设备的型号；测试条件；样品信息；所依据的分析方法文件及其编号，如标准名称及编号等；分析结果；检测人员及日期等。

附录A（资料性）一种脂膜多层结构模型根据溶液散射理论，在稀疏溶液体系中可以忽略粒子间的相互作用，那么完成本底校正后的粒子散射强度Iq可近似为其形状因子Pq，即将散射振幅的平方F( Pq=F(以单层脂质体为例，如果忽略脂质体整体形貌及尺寸对散射数据的影响，只关注脂膜结构特征，那么可以在一定的散射矢量范围内，选择如下脂膜多层结构模型进行结构拟合计算。图A.1一种脂膜多层结构模型示意图在该模型中，平行于膜层的同一平面内的电子密度均一，但是在每个膜层内，沿垂直于脂膜平面方向上的电子密度分布函数为高斯函数，用公式（A.2）表示： ρz=式中：z——沿平面结构的法线方向的坐标位置；ρz——单个脂质体在zi——片层结构模型中各膜层所在的层数；ρiexp−ρi——第iεi——电子密度为ρσi——第i层膜层的电子密度分布标准差。对公式（A.2）电子密度分布函数进行傅立叶变换并进行取向平均后，得到该结构模型的形状因子，用公式（A.3）表示： Pq=q−2通过上述计算模型，拟合实验测得的散射数据与理论散射曲线，使得两者尽可能接近。进一步地，通过此优化求解后的电子密度分布情况，可以得到脂质体脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布特征。各膜层厚度的定义可参考现有技术，根据实际情况进行说明并体现在报告中，如定义膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处。

参考文献[1]国家药品监督管理局药品审评中心，纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行），2021年[2]国家药品监督管理局药品审评中心，脂质体药物质量控制技术研究指导原则，2023年[3]O.Glatter,O.Kratky.SmallangleX-rayscattering.AcademicPress,London,1982.[4]M.H.J.Koch,P.Vachette,D.I.Svergun.Small-anglescattering:aviewontheproperties,structuresandstructuralchangesofbiologicalmacromoleculesinsolution.Q.Rev.Biophys.2003,36,147–227.[5]M.R.Brzustowicz,A.T.Brunger.X-rayscatteringfromunilamellarlipidvesicles.J.Appl.Crystallogr.2005,38,126-131.[6]Y.Schilt,T.Berman,X.Wei,Y.Barenholz,U.Raviv.UsingsolutionX-rayscatteringtodeterminethehigh-resolutionstructureandmorphologyofPEGylatedliposomaldoxorubicinnanodrugs.Biochim.Biophys.Acta.Gen.Subj.2016,1860,108-119.[7]Y.