实验动物学完整版本

实验动物学1.实验动物学绪论2.实验动物质量控制3.常用实验动物4.实验动物营养与饲料5.实验动物环境和设施6.基因工程动物7.“3Rs”理论及其研究进展8.怎样才能作好动物实验实验动物学绪论实验动物：是指经人工培育的、遗传背景清楚、对其携带微生物和寄生虫实行控制、用于科学实验、教学、检定及药品、生物制品生产的动物。实验用动物：实验动物、家畜、野生动物、伴侣动物实验动物科学内容：实验动物、实验动物医学、比较医学、动物实验1988年，国家科委发布《实验动物管理条例》1996年10月，《北京市实验动物管理条例》出台，于2005年1月1日实施实验动物伦理：是人与实验动物关系的伦理信念、道德态度和行为规范。主要体现在尊重实验动物的价值和权利。实验动物福利：实验动物的一种康乐状态。在此状态下，其基本需求得到满足，而痛苦被减至最小。五项基本福利：一，提供适当的清洁饮水和保持健康和精力所需要的食物，使动物不受饥渴之苦二，提供适当的栖息场所，能够舒适地休息和睡眠，使动物不受困顿不适之苦三，做好防疫，预防疾病和给患病动物及时诊治，使动物不受疼痛、伤病之苦四，保证拥有良好的条件和处置（包括安乐死），使动物不受恐惧和精神上的痛苦五，提供足够的空间、适当的设施以及与同类动物伙伴在一起，使动物能够自由表达正常的习性动物实验需要考虑实验动物伦理的几个环节：实验目的确定和必要性评估、实验设计遵循3Rs原则、实验操作过程避免或减轻动物疼痛及恐惧、日常饲养及护理、安乐死CRO：ContractResearchOrganizationInclude:Clinicaltrial、PreclinicalresearchAAALAC认证（国际实验动物管理评估和认证协会）实验动物遗传学控制实验动物按遗传学控制分类：近交系、封闭群（远交群）杂交群近交系：经连续20代以上的全同胞兄妹交配或亲子交配，近交系数大于99%，品系内所有个体都可追溯到第20代或以后代数的一对共同祖先。近交系数：群体中某个体通过遗传携带两个同源等位基因的概率。命名：大写英文字母或大写英文字母加阿拉伯数字命名。BALB,DBA,TA1,C3H等，还有例外：如129等名称缩写：C57BL/6B6BALB/cCDBA/2D2C3HC3主要特征：基因位点的纯合性、遗传组成的同源性、表型的一致性、长期遗传的稳定性、遗传特征的可分辨性、背景资料的完整性动物个体具有相同的遗传组成和特性，因而对实验反应极为一致,只需用少量的动物，即可得到非常规律的实验结果；动物个体之间组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应；每个近交系都有各自鲜明的生物学特点。亚系：由同一个近交系分离出来的有不同特性的分支，这些分支间有遗传差异，称为该品系的亚系。亚系的形成1.兄妹交配20-40代时形成的分支；主要原因是残留杂合2.某分支与其他分支分开繁殖超过100代；主要原因是突变3.发现一个分支与其他分支的差异。原因为残留杂合、突变或遗传污染命名：在品系名称后加一道斜线（/），斜线后标明亚系的符号，亚系的符号可以是以下三种：数字，如DBA/1、DBA/2等。培育或产生亚系的单位或人的缩写英文名称，第一个字母用大写，以后的字母用小写。使用缩写英文名称应注意不要和已公布过的名称重复。例如：A/He，表示A近交系的Heston亚系；CBA/J，表示由Jackson保持的CBA近交系的亚系。当一个保持者保持的一个近交系具有两个以上的亚系时，可在数字后再加保持者的缩写英文名称来表示亚系。如：C57BL/6J，C57BL/10J分别表示由美国杰克逊研究所保持的C57BL近交系的两个亚系。作为以上命名方法的例外情况是一些建立及命名较早，并为人们所熟知的近交系，亚系名称可用小写英文字母表示，如BALB/c、C57BR/cd等。由于遗传污染形成的亚系，通常与原品系之间遗传差异较大，因此对这样形成的亚系应重新命名。例如由GLaxo保持的A近交系在发生遗传污染后，重新命名为A2G。近交系名称中常见的缩写符号：f(fosternursing):代乳、o(ovary):卵巢移植、p:表示移植的胚胎经过冷冻处理、e(egg):受精卵转输、BR:BarrierReared近交系动物命名实例：DBA/1fC57BL/6JDBA:小鼠品系名1：亚系名f：表示代乳C57BL:代乳母鼠品系名称6：亚系名J：亚系名特殊类型的近交系：重组近交系：由两个近交系杂交后，经连续20代以上兄妹交配育成的近交系。命名：由两个亲代近交系的缩写名称中间加大写英文字母X重组同类系：由两个近交系杂交后，子代与两个亲代中的一个进行数次回交（通常2次），通过不对特殊基因进行选择的近亲交配而育成的近交系。命名：两个亲代近交系缩写名称中间加小写字母c。同源突变系：两个近交系，除了一个指明位点等位基因不同外，其遗传基因全部相同的品系。命名：由发生突变的近交系名称后加突变基因符号（用英文斜体印刷体），二者之间以连接号分开。如：DBA/Ha-D同源导入系：通过杂交、互交或回交等方式将一个基因导入到近交系中，所形成的新的近交系只在一个很小的染色体片段上的基因不同，也称同类系。命名由以下三部分组成：a.接受导入近交系缩写名称；b.提供导入基因的近交系缩写名称并与a之间用英文句号分开；c.导入基因符号（英文斜体），与b之间用连字符分开。如：B10.129-H-12b,表示该同类系背景为C57BL/10,导入基因为H-12b,基因提供者为129。封闭群：以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验动物种群,在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4代以上,称为一个封闭群,或叫远交群。命名：封闭群由2-4个大写英文字母命名,种群名称前标明保持者的英文缩写名称,第一个字母须大写,后面字母小写,一般不超过4个字母。保持者名称与种群名称之间用冒号分开。N:NIH美国卫生研究院（N)保持的NIH封闭群小鼠Lac:LACA英国实验动物中心（Lac)保持的LACA封闭群小鼠特例：Wistar大鼠，日本的ddy小鼠等特点：遗传组成具有很高的杂合性；具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成；具有较强的繁殖力、生活力和抵抗力；突变种所携带的突变基因通常导致动物在某方面的异常，从而成为生命科学研究的模型常用封闭群动物：昆明小鼠（KM)、NIH小鼠、ICR小鼠；Wistar大鼠、SD大鼠；Hartley豚鼠；日本大耳白兔、新西兰白兔、青紫蓝兔；Beagle狗杂交群：由不同品系或种群之间杂交产生的后代杂交一代动物（F1代)：两个不同近交系或种群杂交所生的第一代动物命名：雌性亲代名称在前，雄性亲代名称居后，二者之间以大写英文字母―X‖相连，将以上部分用括号括起，再在其后标明杂交的代数（如F1、F2等）例如：（C57BL/6XDBA/2）F1=B6D2F1表示以C57BL/6为母系,DBA/2为父系杂交后生育的杂交一代,可简写为B6D2F1.特征和应用：遗传和表型上的一致性：表型变异率低，对周围环境变化适应性较强，实验反应高度均一；杂交优势：具较强的生命力和对疾病的抵抗能力，寿命较长，适合于保存某些有害基因和长期慢性致死实验，也可作为代乳动物以及卵、胚胎和卵巢移植的受体；杂合的遗传组成：同时具有两个亲本品系的特点，可接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤移植。如何保持实验动物遗传稳定？1严格的繁育制度2按期进行遗传监测：毛色基因测试法；生化标记基因检测法；下颌骨测定法；皮肤移植法实验动物微生物与寄生虫控制实验动物按微生物控制程度分级：1.普通级动物2.清洁级动物3.无特定病原体动物(SpecificPathogenFree,SPF)4.无菌动物1.普通级动物：饲养在普通环境中，不携带人畜共患病和动物烈性传染病病原体的动物。普通级动物应排除的病原体：鼠痘病毒、流行性出血热、狂犬病、猴B病毒、沙门氏细菌、志贺氏细菌、结核分枝杆菌、皮肤真菌、弓形体等2.清洁级动物：饲养在屏障环境，除普通级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。3.无特定病原体动物(SPF)：饲养在屏障环境，无特定病原体的动物。4.无菌动物：饲养在隔离环境，体内外无任何可检出的生命体●已知菌动物：动物体内外所携带的生命体是已知的,也可叫已知菌动物。●悉生动物：悉生动物是由无细菌动物植入已知细菌而得到的。常用实验动物小鼠一般特性：性情温顺、胆小易惊，对外来刺激敏感；昼伏夜出，傍晚开始活跃；喜欢啃咬，非同窝雄鼠好斗雄鼠可分泌醋酸铵臭气；白化小鼠怕强光；不耐饿、不耐热剖学特点：门齿终身生长，需经常磨损来维持恒定；无汗腺,尾有四条明显的血管；胃容量小,约1-1.5ml；淋巴系统发达,外界刺激可使淋巴系统增生；雌性为双子宫,成Y型；有褐色脂肪组织,参与代谢和增加热能；雄鼠生殖器官中有凝固腺，分泌物在交配后凝固与雌性阴道和子宫颈内形成阴栓；雄鼠脾脏比雌鼠明显大，可达到50%生理学特点：成熟早,繁殖力强,一般雌鼠35-50日龄,雄鼠45-60日龄成熟;雌鼠性周期4-5天,妊娠期19-21天,哺乳期20-22天,胎产仔5-16只,每年6-10胎,生育期1年;为全年多发情动物;寿命约为2-3年。大鼠一般特性：性情温顺；嗅觉发达，味觉很差，对营养缺乏非常敏感（特别是VA)喜安静环境，噪音对其繁殖影响很大对环境中的粉尘、氨气和硫化氢等极为敏感，会引起肺大面积坏死对湿度极为敏感，太低易致环尾症解剖学特点●门齿终生生长，需磨损维持其恒定；食道与十二指肠相距很近，胃中有一条皱折，收缩时会堵住喷门口；●肝脏再生能力强，无胆囊，来自各叶的胆管形成总胆管，开口于十二指肠的乳突；汗腺极不发达。●肺结构特别。左肺为1个大叶，右肺分成4叶●心脏和外周循环与其他哺乳动物不同。心脏的血液供给既来自冠状动脉，也来自冠状外动脉●无扁桃体；眼角膜无血管；有棕色脂肪组织生理学特点●寿命为3-3.5年；2月龄时性成熟，为全年多发情动物；妊娠期19-23天；不能呕吐豚鼠一般生物学特性●草食性；胆小、温顺、对外界刺激极为敏感。不伤人，不打斗，喜欢安静、干燥、清洁的环境●喜群居,有专制型社会行为，1-2雄鼠处于统治地位●听觉发达，能识别多种不同的声音，当有尖锐的声音刺激时，常表现耳廓微动，称为普莱厄反射或听觉耳动发射●有食粪癖，食软粪补充营养，幼子从母鼠粪获取正常菌丛解剖学特点●耳蜗网发达，听觉敏锐，音域广；上唇分裂，嚼肌发达；胸腺在颈部，位于下颌骨角到胸腔入口之间●盲肠极大，占腹腔容积三分之一；阴茎端有两个特殊的角形物，呈圆锥状；雌性有阴道闭合膜，一对乳腺生理学特点●性成熟早，雌鼠30-45日龄，雄鼠70日龄，妊娠期59-72天,一般产仔3-4只，哺乳期2-3周●出生时即被毛完整，一小时后可走动，数小时后能吃食●寿命一般4-5年，最长可达8年。2月龄体重可达350克，5月龄可达700克●自动调节体温能力较差，饲养最适温度18-22度;●体内缺乏左旋葡萄糖内酯氧化酶，其自身不能合成维生素C●易被致敏、引起变态反应，对免疫抑制剂敏感应用●免疫学血清中含有丰富的补体，血清学诊断上的―补体‖就是由豚鼠血清制成，常用补体结合试验来进行实验诊断；●营养学体内不能合成维生素C,对维生素C缺乏十分敏感，如果饲料中缺乏时，很快会出现一系列坏血病症状，是目前唯一用于研究实验性坏血病的动物；●各种传染病的研究：豚鼠对很多致病菌和病毒十分敏感过敏反应或变态反应的研究；豚鼠对缺氧的耐受性强；毒物对皮肤局部作用实验仓鼠（地鼠）一般生物学特性杂食性动物，有储存食物的习性，可将食物存于颊囊内牙齿坚硬，可咬断细铁丝；有食仔癖；昼伏夜出，嗜睡，熟睡时全身松软，如死亡状，不易醒?室温18-22度为宜，低于9度时可出现冬眠（中国地鼠无冬眠现象）；好斗，受惊吓时会咬人，雌性比雄性大且凶猛解剖学特点●口腔内两侧各有一个颊囊，常用来运输和储存食物；中国地鼠无胆囊；盲肠较大，结肠长（水的利用率高）生理学特点●妊娠期15-17天，哺乳期21天，每年可产5-7胎，每胎产仔约7只，平均寿命2-3年；成年体重约为150克地鼠对皮肤移植的反应特别，封闭群内个体间皮肤移植常可存活，并能长期生存下来，但不同群体间移植则100%排斥颊囊缺少组织相容性反应，可进行肿瘤移植家兔一般生物学特性●草食性动物，性情温顺，群居性差；听觉嗅觉灵敏，胆小怕惊；喜干怕热；夜行性、嗜眠性●食粪特性；喜磨牙，有啃木、扒土习惯解剖学特点●六颗切齿，比啮齿动物多一对小切齿；●胸腔由纵隔分为互不相通的左右两部，纵隔由膈胸膜和纵隔胸膜两层胸膜组成，肺被肋胸膜和肺胸膜隔开，心脏又被心包胸膜隔开。因此，开胸心脏手术无需人工呼吸；●颈部神经血管特殊，有减压神经的独立分支和迷走神经与交感神经干完全分开生理学特点●恒温动物，对致热物质反应敏感，适于用做热源实验●刺激性排卵，妊娠期30-33天，产仔数4-10只，哺乳期40-45天，生育年龄5-6年，平均寿命8年●胃常处于排空状态，不会呕吐；尿液呈碱性(pH8.2)，饥饿时尿液变酸(pH6-7)，幼兔尿偏酸犬一般生物学特性●嗅觉、听觉、触觉灵敏●视力很差，视角25度以下，视野20-30米，红绿色盲●正常的犬鼻尖呈油状滋润，触摸有凉感●喜欢肉类的脂肪，习惯啃骨头，味觉差解剖学特点●嗅脑、嗅觉器官、嗅神经发达，鼻粘膜上布满嗅神经；无锁骨，肩胛骨由骨骼肌连接躯体●食道全部由横纹肌构成；发达的心血管和神经系统，内脏与人相似●唾液中缺少淀粉酶；皮肤汗腺极不发达，趾垫有少量汗腺比格犬：又称小猎兔犬猫一般生物学特性：交配后24小时开始排卵，属典型刺激性排卵。对呕吐反应灵敏，受机械和化学刺激易咳嗽；平衡感好，血压稳定动物实验替代方法3R：Reduction（减少）：在科学研究中，通过科学合理的实验设计，使用少量动物获取同样多的实验数据或使用一定数量的动物获得更多实验数据的科学方法。绝对数量的减少（实验动物用量下降）—相对数量的减少（实验数据获取量上升）Replacement（替代）：使用没有知觉的实验材料（体外方法）替代活体动物（体内方法），或使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。Refinement（优化）：在符合科学原则的基础上，通过改善实验环境条件，善待动物，提高动物福利；或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。动物实验仁慈终点：仁慈终点是动物遭受疼痛、痛苦或是动物濒临死亡前的最早指征，它是人为确定的、具有典型的临床表现、并在达到试验目的前提下可以终止试验的某一阶段（点）。选择仁慈终点的目的是能够在对大程度上减轻动物所承受痛苦。科技部在2006年11月7日发布了科学技术部令第11号《国家科技计划实施中科研不端行为处理办法（试行）》，明确见―违反实验动物保护规范‖列为六种不端行为之一，需要进行坚决治理。实验动物营养与饲料水对水的摄取:饲料中（不推荐用青饲料作为水源，可能会伴随潜在寄生虫感染）;饮水蛋白质粗蛋白：蛋白质：由氨基酸组成非蛋白氮：未结合成蛋白质分子的个别氨基酸、植物体中由无机氮合成蛋白质的中间产物和植物蛋白质经酶类和细菌分解后的产物等必须氨基酸与非必须氨基酸●必须氨基酸：动物体内不能合成，必须由饲料来提供。其中，赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸在植物性饲料中常不足，缺乏还会影响其它氨基酸利用，又被称为限制性氨基酸。●非必须氨基酸：动物体内能够合成。氨基酸平衡与氨基酸失衡●氨基酸失衡：一种或几种必需氨基酸过多或过少，相互间比例与动物的需要不一致，从而造成饲料利用率降低，生长迟缓、繁殖力下降的现象。蛋白质含量不足或氨基酸比例不当●生长发育缓慢，体重减轻；抵抗力下降，贫血，低蛋白血症，水肿等；影响生殖。蛋白质含量过高:引起代谢紊乱，严重者甚至出现酸中毒脂肪来源:动物性脂肪、植物性脂肪亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸在动物体内不能合成，称为必需脂肪酸。必需脂肪酸对维持细胞及亚细胞结构的功能和完整性很重要，还参与类脂代谢，在调节胆固醇代谢，特别是输送、分解和排泄方面有重要意义。亚油酸是合成前列腺素的原料。碳水化合物及其营养功能分为粗纤维：纤维素、半纤维素、木质素等所组成草食性动物，粗纤维是必不可少的，如不足可造成消化机能紊乱，消化道疾病等。反刍动物和马属动物，粗纤维在瘤胃及盲肠中经发酵形成挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸），参与碳水化合物代谢，通过三羧酸循环，形成高能磷酸化合物，产生热能。可溶性碳水化合物矿物质常量元素（占动物体重的0.01％以上）包括钙、磷、钠、氯、硫、镁、钾等微量元素（不足体重的0.01％）包括铁、铜、锌、锰、碘等元素。钙和磷：含量最多，占机体矿物质总量的70％以上，既要保证适量的钙磷数量又要保持两者适宜的比例维生素大多数在动物体内不能合成，必须由饲料或肠道寄生的细菌合成后提供。正常情况下,水溶性维生素和维生素K不会缺乏，但在高温灭菌时应当给予补充。豚鼠和灵长类动物体内不能合成维生素C，必须在饲料中供给。脂溶性维生素：DAKE,吸收后可在体内贮存，短期供给不足不会对生长发育和健康产生不良影响。维生素K:一般不会缺乏，因广泛存在于饲料中，且大肠内的细菌也能合成，但无菌动物可发生维生素K缺乏。水溶性维生素:BC.由于很少或几乎不在体内贮存，水溶性维生素短时间缺乏或不足均会引起体内某些酶活性的改变，阻抑相应的代谢过程，从而影响动物生长发育和抗病力具有食粪癖的动物如兔，可从粪中得到维生素B族的补充各种营养素间的关系能量物质和蛋白质的比例（也称为蛋能比）应适当，不当会影响营养素的利用率，甚至造成营养障碍粗纤维与其他营养素的利用一般呈负相关，但对于草食动物是必需的一种营养素蛋白质的供给量对某些维生素如A、D、B2等的吸收也有明显的影响脂类含量与维生素尤其是脂溶性维生素的吸收有明显关系高脂饲料会影响钙的吸收，高蛋白质饲料则能提高机体对钙磷的吸收实验动物的营养需要维持需要生长需要繁殖需要影响动物营养需要的主要因素遗传和环境因素：不同品种动物营养需要明显不同；各品系间营养需要有明显差异；在隔离或屏障环境中饲养动物其营养需要和同品系在普通环境中饲养动物的营养需要差别明显小鼠营养需要特点：饲料中含18-20%左右的蛋白质即可；喜糖；泌乳期喜脂；对维生素A的过量很敏感,特别是妊娠小鼠,过量会造成胚胎畸形；对维生素A和D的需要量较高，应注意补充。大鼠营养需要特点：18-20%的蛋白质；生长期的大鼠易发生脂肪酸缺乏，饲料中必需脂肪酸的需要量应占热能物质的1.3％；对镁的需要量较高，应注意补充。生长期以后蛋白质需要量锐减，可适当减少蛋白质量；豚鼠营养需要特点：对几种必需氨基酸需要量高，尤其是精氨酸；粗纤维需要量高，不足可发生排粪较粘和脱毛现象；不能自身合成维生素C，对其缺乏特别敏感，地鼠营养需要特点:像反刍动物一样有效利用非蛋白氮;蛋白质需要量高，如不足成年地鼠将会出现性机能减退，幼鼠则生长发育迟缓,一般要求达到21-24%;胆固醇代谢较特殊家兔营养需要特点：草食性，应注意提高饲料粗纤维含量；蛋白质：14-17%；可耐受高钙；初生时铁储备高，故不易贫血；通过食粪行为可利用肠道微生物合成的B族维生素和维生素K狗营养需要特点：能耐受高脂肪，要求日粮中有一定水平的不饱和脂肪酸；维生素A需要量大。尽管肠道内微生物可合成B族维生素，但仍需要补充维生素B12；肉食性，应考虑适口性，动物性蛋白应占全部蛋白饲料的三分之一，蛋白质含量要求22-25%猴营养需要特点：自身不能合成维生素C猫营养需要特点：饲料中需加一定量牛黄酸；饲料中亚油酸含量应大于1%饲料的消毒：干热、湿热、辐照、药物熏蒸动物实验及动物实验技术实验动物选择原则：相似性、特殊性、标准化、规格化、经济性大鼠肝脏再生能力强，切除60-70%肝叶仍有再生能力，适合肝外科实验研究。但大鼠无胆囊，不能用作胆囊功能研究。人类疾病动物模型：是研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和相关材料动物模型复制原则：相似性、可重复性、可靠性、适用性喝可控性、易行性喝经济性动物模型分类按产生原因分类：自发性动物模型、诱发性或实验性动物模型影响动物实验结果的主要因素：R=(A+B+C)×D±EA:动物种的共同反应B:动物品种、品系特有的反应C:动物的个体反应D:环境因素（包括实验处理）E:实验误差A,B,C是由实验动物本身的遗传因素决定的，被选择的实验动物，在严格控制环境因素D或改变其中某一条件后就可能得到一个理想的实验结果R影响动物实验的主要因素：动物因素、环境因素、营养因素、实验技术因素基本动物实验技术动物的编号：染色法：一般适用于短期实验，大、小鼠常用耳缘剪孔法：适用于长期实验，大、小鼠常用挂牌法：适用于猫、犬等如何做好动物实验？1、明确目的及必要性2、确认必要性―3R‖原则；动物实验伦理和动物福利3、作好实验设计：对照原则随机化原则重复原则均衡性原则4、选择适宜的实验动物：实验动物遗传特性的选择实验动物微生物等级的选择实验动物数量、规格和性别的选择5、做好实验操作和实验条件保障工作6、搞好动物实验结果的统计、分析和资料的整理、归档工作研究论文中有关实验动物的描述：(1)品种、品系描述清楚；(2)来源明确；(3)体重明确；(4)等级明确；(5)饲养环境和实验环境明确；(6)性别明确；(7)有对饲养方式的描述(如饲料类型、营养水平、照明方式、温度、湿度要求)；(8)所用动物数量准确；(9)对动物的健康状况的描述详细；(10)对动物实验的处理方式有单独清楚的交代；(11)动物福利伦理审查情况。转基因动物定义:用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。整合的外源基因称为转基因（transgene)转基因小鼠的制备原理与方法(一)转基因小鼠制备的基本程序：1.选择小鼠品系，可以用远交系也可以用近交系。一般采用两种近交系的杂交一代。2.准备不育雄鼠和假孕母鼠。用输精管结扎的方法制备不育雄鼠，不育雄鼠与雌鼠交配可获得假孕母鼠。3.收获受精卵-超排卵4.将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫内发育。5.首建转基因鼠(founder)中转基因的检测。6.通过繁育建立转基因小鼠品系。（1）.互交得到转基因纯合子小鼠（2）.回交至少10代建立纯系转基因小鼠（二）外源基因导入方法：1.显微注射法。2.逆转录病毒载体法。3.电脉冲法。转基因动物的应用：1.基因功能的研究2.建立转基因动物生物反应器3.异种器官移植基因打靶（Genetargeting）(一)基因打靶的原理：DNA同源重组的原理打靶载体(targetingvector)：根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targetingvector)。(二)基因打靶的方法：进行基因打靶要经历以下步骤：（1）构建打靶载体。――在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序外源基因插入这一同源序列之中。（2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonicstemcell，即ES细胞)。外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频正负选择法：－（3）打靶ES细胞导入囊胚。（4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。基因打靶小鼠的繁育用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体小鼠，并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因，为获得纯合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交。回交后出生的子代鼠中有杂合子的小鼠(-/+)。再用杂合子小鼠互交，从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因打靶小鼠。(三)组织特异性基因打靶：Cre/loxP系统(四)外源基因的时间可控性表达：用编码Cre重组酶与人雌激素受体(ER)融合蛋白的基因制备了Cre–ER转基因小鼠，给这种转基因小鼠注射人雌激素，可诱导Cre–ER的大量表达。再用插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反，则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。实验动物环境设施控制实验动物环境设施控制：一、实验动物设施概念：是从事饲养、育种、保种、生产、动物实验等的建筑物、设备以及运营管理在内的总和。它是由实验动物繁育、生产设施和动物实验设施两部分组成。二、实验动物环境设施分类：分为三级，控制程度从低到高，依次为普通环境：教学等用途的普通实验动物屏障环境：清洁实验动物及SPF隔离环境：悉生、无菌实验动物及SPF单走廊房间的压强：SPF室>内室>缓冲间>外室层流架：正压型层流架主要用于清洁动物或SPF动物的饲养；负压型层流架，主要用于感染动物的饲养。三实验动物饲养常用的辅助设施：笼具、笼架、饮水装置、运输笼和垫料等水：屏障和隔离环境内饲养的实验动物饮用水须经灭菌处理实验动物的饮水一般无需作蒸溜、离子交换或反渗透等处理，有助于动物对微量元素的利用。垫料：吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂的材料。环境因素对