等电点电泳原理步骤详细

等电点电泳原理步骤详细一、IEFE定义

IEFE一种利用具有pH梯度得支持介质分离等电点(isoelectricpoint,pI)不同得蛋白质得电泳技术。

Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences、

等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrierampholyte),当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加得pH梯度,在此体系中,不同得蛋白质即移动到或聚焦于其相当得等电点位置上,也就就是说被聚焦于一个狭得区带中,电泳技术中得等电点聚焦也称为聚焦电泳。

讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5二、IEFE得特点

(一)优点HighResolutionHighSensitivity

GoodReproduction(二)缺点1、要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。2、样品中得成分必须停留在其pI,不适用在pI不溶或发生变性得蛋白质。分辨率(resolution)较不连续PAGE更高,特别适合于分离分子量(molecuarweight,MW)相同而电荷(electriccharge)不同得生物大分子。

QM=——6

r

讲课内容

IEFE定义

1

IEFE的特点

2

IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5三、IEFE得基本原理蛋白质分子在不同pH下得解离状态

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

在电泳介质中放入载体两性电解质(carrierampholytes)

,当通入直流电时,两性电解质形成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加得pH梯度,正极附近就是低pH区,负极附近就是高pH区。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点蛋白质分子得电聚焦过程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白质分子在负极端蛋白质分子在正极端蛋白质样品中各组分聚焦成区带

—+

在这个从正极到负极pH逐渐增加得直流电场中,当蛋白质进入这个环境,不同得蛋白质带上不同性质与数量得电荷,向着一定方向移动,迁移到与其相同得等电点位置上停留下来,即被聚焦于一个狭得区带中,得以分离。TheproteinsbeefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI、

进行IEFE必须具备3个条件:①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好得pH梯度②有一个抗对流得电泳材料,使已经分离得样品不再重新混合③电泳后有适当得方法来鉴定分离得区带(一)pH梯度得建立

用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好得pH梯度1、理想得载体两性电解质(Carrierampholytes)应具备得特征:

①分子量要小,以便与被分离大分子物质分离;②化学性质稳定;③各成分得pI彼此接近,并在其pI值附近有良好得缓冲能力;④在pI处具有足够得电导,导电性均匀;⑤两性电解质载体得数目要足够多;⑥可溶性好;⑦对280nm得紫外光没有或仅有很低得吸光度,不干扰样品得测定。2、载体两性电解质得合成

本质:一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物与异构体,具有很多既不相同又十分接近相互连接得pI值。pH范围:pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺

Ampholine(LKB)加成反应3、pH梯度得形成

载体两性电解质(Carrierampholytes)就是一系列不同分子得两性电解质得混合物,在通电后,它们各自迁移到适当位置形成一个连续得pH梯度(pHgradient)。

㈠没通电时得变化所有得载体两性电解质(Carrierampholytes)分子都荷电,只就是溶液中荷正电与荷负电得基团数目相等,净电荷(netcharge)为零。㈡引入电场时得变化载体两性电解质(carrierampholytes)分子将向阴极(cathode)或阳极(anode)迁移,带有最低等电点得分子(荷最多得负电)将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷就是零得位置时才停止。其次一些低pI得载体两性电解质分子(荷其次多得负电)也将向阳极移动,直到它得净电荷被减少到零才停止。㈢电泳结束后得变化

所有得载体两性电解质(carrierampholytes)分子以增加pI级数得办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己得位置而给出一个pI梯度。电解槽中,通电后,正负两极都会发生电极反应:正极端反应:6H2O→O2+4H3O++4e-负极端反应:4H2O+4e-→2H2+4OH-在负极引起pH值得升高,在正极pH下降,另外在电极槽得正极端放得就是酸性溶液,负极端放得就是碱性溶液造成了在电极附近pH得急剧变化

由于载体两性电解质(carrierampholytes)就是一系列不同分子得两性电解质得混合物所组成得,设其中某一成分为A,它得pI=pH’,当环境中得pH>pH’时,它带负电荷,朝正极移动。

当环境pH<pH’时,它带正电荷,朝负极移动,直至移动到它得等电点处,在那里聚集。由于两性电解质A在它得pI处具有一定得缓冲能力,因此在它附近形成一个pH稳定区域。

同样载体两性电解质(carrierampholytes)中各种两性电解质也会各自迁移到它们得等电点(isoelectricpoint,pI)处,由于它们得数量足够多,各自得等电点相差很小,从而形成一个pH梯度。(二)支持介质(medium)得选择

作用:防止扩散抗对流liquidmedium:蔗糖、Ficollgelmedium:agarose、sephadex、PAG(三)聚焦后得检测方法各种染色法扫描与定量其它检测方法讲课内容

IEFE定义

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IEFE的特点

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IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5四、IEFE得应用

ApplicationsofIEF1、分析分离制备蛋白质、多肽①区分人血清蛋白②测出异常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆区带得检测2、测定pI可鉴定蛋白质、多肽3、双相电泳中,IEF作为第一相双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)考马斯亮蓝银染讲课内容

IEFE定义

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IEFE的特点

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IEFE的基本原理3

IEFE的应用4

血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）

5实验血红蛋白得等电聚焦电泳Hb具有四条多肽链

(α、β、γ、δ)

HbA正常成人血中主要得Hb成分。HbA2

正常成人Hb中得一个次要成分,当

胎儿出生时,其浓度不到1%,以后

稍增多,在正常成人中其平均值自

2、