DB2305-T 040-2024 水稻纹枯病菌分离及鉴定技术规程

ICS65.020.20DB23052024-08-30发布双鸭山市市场监督管理局发布IDB2305/T040—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由双鸭山市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院佳木斯分院、宝清县小城子镇乡村振兴发展服务中心、芜湖职业技术学院。本文件主要起草人：杨晓贺、姚亮亮、于昌红、顾鑫、吴彦龙、高忠臣、丁俊杰、高雪冬、邱磊、张茂明、王自杰、张家智、付久才、马瑞、刘伟、王庆胜、黄成亮。1DB2305/T040—2024水稻纹枯病菌分离及鉴定技术规程本文件规定了水稻纹枯病样本的采集与保存，病原菌的分离、纯化、鉴定及保存技术要求。本文件适用于水稻纹枯病菌的分离和鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1水稻纹枯病由立枯丝核菌侵染引起的一种水稻真菌病害，主要危害叶鞘、叶片形成云纹状病斑。田间症状见附录A。3.2单菌丝分离利用真菌培养时不产生分生孢子而产生快速生长菌丝的特点，切取菌丝前端进行菌丝分离，以获得纯化菌株。4仪器和用具4.1常用仪器4.1.1超净工作台洁净等级100级@≥0.5um。平均风速0.25m/s～0.6m/s。4.1.2高压灭菌锅稳定范围0℃~135℃。灭菌时间范围4min～120min，最高工作压力0.22MPa～0.25MPa。4.1.3光照培养箱稳定范围0℃~50℃。稳定波动±1℃。光照度0LX～7500LX。2DB2305/T040—20244.1.4光学显微镜4.1.5电子天平感量0.01g。4.1.6常用工具剪刀、培养皿、吸水纸、接种针、试管、酒精灯、记号笔、载玻片、盖玻片、镊子，医用纱布等。5样本采集与保存水稻成熟期从田间剪取发病茎秆（其特征见附录B），按品种及采集地装入牛皮纸袋，贴上标签，注明采集时间、地点和水稻品种，带回实验室。放置于4℃冰箱内保存备用。6分离技术6.1培养基的配制6.1.1水琼脂培养基将20g琼脂粉加水煮沸后定容至1000mL，配制成2%水琼脂培养基。121℃湿热灭菌25min。6.1.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）将去皮马铃薯200g切成小块，加水1000mL煮沸25min，用四层纱布过滤，过滤后加入琼脂20g，再煮沸后加入葡萄糖20g，加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌25min。6.2病菌分离将病组织用自来水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水珠，将病组织剪成长宽各2mm×5mm的小块，将其放置于水琼脂平板上，每个平板放置5块病组织，置于25℃光照培养箱内培养（见附录C）。培养24h后，病组织周围即可长出具有立枯丝核菌菌落特征的菌落（见附录D），在无菌操作台内切取菌落边缘的菌丝前端，置于PDA平板上纯化。6.3病菌的纯化单菌丝分离将水稻纹枯病菌置于水琼脂平板上，25℃培养2d后，用切刀切取菌丝前端约1mm长度的菌丝置于水琼脂平板上，25℃培养。如此操作3次。7菌种保存3DB2305/T040—2024将6.3纯化的菌株转入PDA试管斜面内，25℃培养15d，放置于4℃冰箱内保存备用（见附录E）。8病原菌的鉴定形态学观察法。选取干净的载玻片，在载玻片上用吸管放置适量清水，挑起纯化后的病原菌的菌丝放置清水上，盖上盖玻片，利用光学显微镜显微观察。参照立枯丝核菌形态学典型特征（附录F）进行比对，确定其为水稻纹枯病菌。9病原菌的致病性测定将牙签剪成1cm短签，经121℃湿热灭菌30min后，将短签放置在PDA平板上，1个PDA平板内放置20个左右短牙签。将待测菌株接种至装有短牙签的PDA平板内，28℃培养7d～10d，将带有菌丝的短牙签接种至水稻叶鞘内（见附录G），接种72h后观察，出现典型水稻纹枯病症状（附录H），将发病叶鞘采集至实验室，重复6.2、6.3和8操作，确定其为水稻纹枯病菌。4DB2305/T040—2024水稻纹枯病田间症状水稻纹枯病田间发病初期，叶鞘呈现云纹状病斑，生育后期形成菌核。水稻纹枯病田间发病症状特征见图A.1。图A.1水稻纹枯病发病茎秆5DB2305/T040—2024水稻纹枯病标本特征水稻纹枯病发生于叶鞘、叶片及穗部。用于水稻纹枯病菌分离的标本以发病茎秆为宜。水稻纹枯病发病茎秆症状特征见图B.1。图B.1水稻纹枯病发病茎秆标本6DB2305/T040—2024水稻纹枯病菌分离培养皿将清洗干净并用吸水纸吸干水分的水稻纹枯病发病叶鞘样本进行剪切，剪成2cm×5cm的小块，将其放入水琼脂平板上，每个平板放置5块病组织，置于25℃培养箱内培养。分离培养皿内样本摆放，见图C.1。图C.1分离培养皿内样本摆放7DB2305/T040—2024立枯丝核菌特征的菌落立枯丝核菌菌落生长快，菌丝平铺生长，起初白色，图D.1为立枯丝核菌25℃培养36h菌落特征。图D.1立枯丝核菌25℃培养36h菌落特征8DB2305/T040—2024水稻纹枯病菌的保存纯化的水稻纹枯病菌菌株转入PDA试管斜面内，25℃培养15d，放置于4℃冰箱内保存备。图E.1为4℃冰箱内保存30d的立枯丝核菌菌株PDA试管斜面。图E.14℃冰箱内保存30d的立枯丝核菌菌株PDA试管斜面9DB2305/T040—2024立枯丝核菌形态学典型特征立枯丝核菌菌落生长快，菌丝平铺生长，粉状，起初白色，后逐渐变褐色，背面变褐；不育菌丝直角分枝，分枝处有缢缩，缢缩处宽5µm～8µm；念珠状细胞成串向顶部生长；7d后可产生肉眼可见的菌核，菌核初为白色菌丝纠结在一起形成的团状物，后期变褐色，坚硬，大小不一，1mm~2mm。见图F.1.BACA图F.1立枯丝核菌A.PDA上5d菌落及其背面B.菌丝直角分枝C.念珠状细胞DB2305/T040—2024短牙签接种将牙签剪成1cm短牙签，短牙签经121℃湿热灭菌30min后，将牙签放置在PDA平板上，1个PDA平板内放置20个左右短牙签。将待测菌株接种至装有短牙签的PDA平板内，28℃培养7d～10d，将带有菌丝的短牙签接种至水稻叶鞘内（附录