《DNA片段的PCR扩增》教案

4/4实验13DNA片段的PCR扩增【学习目标】1.了解PCR技术的操作原理与方法。2.进行DNA片段的PCR扩增。【教学重点】PCR的原理和PCR的基本操作【教学难点】PCR的原理【教学方法】运用“指导——创新”实验教学模式。这种教学模式的基本含义是：以实验活动为基础，以改进、完善、设计实验为切入点，发展学生的创新能力、培养学生积极的个性特征和科学态度【教学过程】（一）引入新课在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。（二）进行新课1.基础知识PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：1.1细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3’端起点1.2细胞内DNA复制过程（1）DNA的反向平行结构：核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。DNA双螺旋结构的反向平行结构：（2）DNA的复制过程:解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。1.3DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4.PCR的反应过程延伸复性变性延伸复性变性变性：在95℃复性：在50℃时引物与DNA单链结合延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）2.实验操作2.1标记好3个0.5ml微量离心管，依照课本P68表依次加入试剂，关闭上盖并在振荡器上震荡20s，使之混合均匀。2.2将3个微量离心管放到固定器上，保证每管中的液面在水浴中的水面以下，依照课本P68时间表依次放入3个水浴进行PCR。有条件的可用PCR仪，将微量离心管放到PCR的管架上。2.3电泳。将TBE缓冲液加入到电泳槽中，使缓冲液高出凝胶面3-4mm，再将20μl蓝色的缓冲液充分混匀后，加到凝胶板的加样孔中。另取3支微量离心管吗，标记管号，分别加入20μlPCR产物和2μl蓝色加样缓冲液。混合后分别加到3个凝胶板上的小池中，然后进行电泳。如果用18V电池约进行电泳4-6h，如用直流电泳仪电源，80V电泳40min。2.4电泳后将凝胶缓冲液倒出，缓冲液可再利用。将10ml染色液（亚甲蓝）覆盖在凝胶表面，15-20min后，移去染色剂，再加入5ml70％乙醇，不断摇动1-2min，使乙醇分布均匀，再除去乙醇，加入冷水，几分钟后看到蓝色的区带出现，这就是扩增的DNA。从图谱中也可看出12个循环和14个循环之间的扩增量的区别。【课余作业】1.PCR与生物体DNA复制有何区别？2.如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？【教学体会】教师在教学过程中，可以先引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了