B型流感疫苗株生物反应器培养工艺优化

第第页B型流感疫苗株生物反应器培养工艺优化中国农业科学院与山西农业高校等多个团队通力合作，在病毒学报在线发表题为B型流感疫苗候选株在MDCK悬浮细胞上培养工艺优化研究，通过选株rIBV在MDCKs细胞上的生物反应器培养工艺进行了优化，获得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs细胞源疫苗候选株rIBV，为下游流感疫苗生产及纯化工艺奠定了基础。季节性流感是由活着界各地流行的流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病。目前在人类中流行的重要有B型流感病毒等病毒，防备接种疫苗仍然是我国当今应对流感暴发的有效措施。MDCKs细胞全悬浮培养则不需要添加血清，相较于鸡胚培养，Vero细胞培养具有更好的稳定性和安全性，同时借助生物反应器能够供应大量同步分裂、增殖快的细胞，更能够保证疫苗质量，是当前疫苗生产的主流工艺。为了大规模生产重组B型流感疫苗候选株rIBV，研究探究了rIBV在无血清MDCKs细胞上的最佳培养条件，再扩大到生物反应器中优化工艺参数，经过连续传代15代后测定了MDCKs细胞源毒种rIBV的遗传稳定性和病毒滴度。通过对病毒培养条件进行优化，确定了rIBV在MDCKs细胞上增殖的最佳培养条件是TOI为72h、MOI=0.001、CCI为4.010^6细胞、TPCK胰酶浓度为2g/mL、50%DO和pH=7.20.5、rIBV在MDCKs细胞上连续传代15代后仍然具有高度遗传稳定性。相比于鸡胚源rIBV株，适应MDCKs细胞生长15代后rIBV株的EID50由106.25/mL提高至109.5/mL，TCID50由104.5/mL提高至108.25/mL。MDCKs细胞生物反应器培养MDCKs细胞经摇瓶逐级扩大培养后，取生长良好的细胞以初始密度为1.510^6细胞接种到调试好的5L生物反应器，采用搅拌式培养，有效培养体积为3L，传代密度参照摇瓶中优化确定的培养条件，其他关键参数：温度为（370.1）℃，pH值7.20.3，DO值50%，搅拌转速100r/min，连续培养120h，每12h取细胞培养样监测细胞密度及细胞活率，做三次重复；期间每隔24h取样，依照试剂盒说明书步骤处理样品，测得葡萄糖、乳酸和谷氨酸含量，并进行细胞计数，每次做三个重复。最佳DO的筛选MDCKs细胞经摇瓶逐级扩大培养后，取生长良好的细胞以初始密度为1.510^6细胞接种到调试好的5L生物反应器，采用搅拌式，有效培养体积为3L，相关参数参照摇瓶中优化确定的培养条件，关键参数：温度为（330.1）℃，pH值7.20.05，DO设30%、50%、70%三个对照，搅拌转速120r/min，每24h取细胞培养样测HA效价，每次做三个重复。MDCKs细胞接种到5L生物反应器中，设置关键参数：温度为（330.1）℃，pH值7.20.05，搅拌转速120r/min，确定最佳DO，实50%DO作为后续反应器培养的设置条件。最佳pH的筛选MDCKs细胞经摇瓶逐级扩大培养后，取生长良好的细胞以初始密度为1.510^6细胞接种到调试好的5L生物反应器，采用搅拌式，有效培养体积为3L，相关参数参照摇瓶中优化确定的培养条件，关键参数：温度为（330.1）℃，DO值依照优化好的值设定，pH值为6.8、7.0、7.2、7.4设四个对照，死区设为0.05，搅拌转速120r/min，每24h取细胞培养样测HA效价，每次做三个重复。MDCKs细胞接种到5L生物反应器中，设置关键参数：温度为（330.1）℃，DO值50%，搅拌转速120r/min，确定最佳DO。我们选择pH值为7.2为生物反应器培养条件，死区设置为0.05、结果B型重组嵌合病毒rIBV在MDCKs细胞上连续传15代后获得一株高滴度且遗传稳定的MDCKs细胞基质疫苗株。我们对传代过程中病毒的生长特性及遗传稳定性进行了研究，rIBV依照生物反应器优化条件，筛选出一株既遗传稳定又具有高滴度的疫苗株rIBV，病毒滴度的增高也证明白MDCKs细胞其作为疫苗生产基质更具有价值。本研究优化了rIBV在MDCKs细胞上的增殖条件，并成功放大到5L生物反应器，经过连续传代获得一株高感染力和病毒滴度的MDCKs细胞基质rIBV疫苗株，为后续高质量疫苗的大批量生产奠定了基础。生物反应器培养可获得更高的收益率，生物反应器的掌控系统可以完成更多工作，可监测和掌控的参数数量基于生物反应器中的传感器和掌控元件数量，可以更好的进行培养工艺条件的筛选，优化。工艺简单、操作敏捷，有良好的适用性；培养工艺容易放大，可为生物体生长和增殖供应均质的环境；产品质量稳定，特别适合工业化生产；管路布置较为简单，能供应较好的无菌条件，细胞生长过程中不易污染。艾贝泰深耕生物制药领域，凭借在生物反应器行业近20年的经验沉淀，致力于打造高端自主生物反应器，公司拥有超150人研发团队，历经数年打磨，现郑重推出AbioBundle系列玻璃