DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法

两系水稻不育基因鉴定功能标记法Identificationoftwo-linericemalesterilegenes—functionalmarkermethodHYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准归口单位：安徽省农业标准化技术委员会。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所。本标准主要起草人：宋丰顺、杨剑波、倪大虎、倪金龙、陆徐忠、李莉、汪秀峰、魏鹏程、杨亚春、马卉、李浩、秦瑞英、许学、李娟。1两系水稻不育基因鉴定功能标记法本标准规定了两系水稻不育基因功能标记检测的术语和定义、原理、主要仪器、试剂与溶液、操作步骤、带型记录和结果判定。本标准适用于两系水稻不育基因鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4404.1粮食作物种子第1部分；禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。功能标记FunctionalMarker根据基因内部引起表型性状变异的功能突变位点开发出来的一种分子标记。两系水稻Two-LineRjce/b本标准将两系不育系和两系杂交水稻统称为两系水稻。两系不育系是指利用水稻的光温敏核不育特性选育的水稻雄性不育系，其在短日低温条件下表现为雄性可脊，奇以繁殖种子，在长日高温条件下表现为雄性不育，可用于杂交稻制种。两系杂交水稻是指利用两系不育系与恢复系杂交产生的F1代。标准样品StandardSample标准样品是指经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品。本标准中包括阴性标准样品和阳性标准样品。阴性标准样品是指不携带pms3基因和tms5基因的水稻种子、幼叶或DNA。2阳性标准样品是指携带pms3基因或tms5基因的水稻种子、幼叶或DNA,包括pms3型不育系标准样品、pms3型杂交水稻标准样品、tms5型不育系标准样品和tms5型杂交水稻标准样品。送验样品SubmitSample送到种子检验机构检验的样品。4.1生产上大规模应用的两系水稻按其不育基因种类可分为pms3型和tms5型两类。4.2根据不育基因pms3和tms5的功能突变位点序列与可育基因(PMS3和TMS5)不同，设计引物，扩增功能突变位点，用限制性内切酶特异切割不育基因的扩增产物，而不酶切可育基因的扩增产物，形成片段长度多态，从而将不育基因、可育基因以及两者的杂合体区分开。5主要仪器5.1PCR扩增仪5.2离心机：最大离心力≥12,000g5.3电泳检测系统：水平电泳系统5.4微量移液器：规格分别为2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL,连续可调5.5低温冰箱：最低温度-20℃5.6凝胶成像系统5.7高压灭菌锅5.8电子天平：精确度0.001g5.9恒温水浴锅：温控精确度±1℃5.10磁力搅拌器5.11微波炉5.12紫外分光光度计5.13酸度计：精度±0.01pHHYPERLINK6.1试剂要求仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。6.2.1十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)6.2.2三羟甲基氨基甲烷碱(Tris-Base)6.2.3乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)6.2.4浓盐酸6.2.5氢氧化钠6.2.6氯化钠36.2.7三氯甲烷6.2.8异戊醇6.2.9异丙醇6.2.10无水乙醇6.2.12DNA聚合酶及其GCBufferI和GCBufferII6.2.13四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP),缩略为dNTPs6.2.14限制性内切酶RsaI6.2.15两系水稻不育基因功能标记引物(引物序列见附录A)见附录B。7操作程序7.1样品制备7.1.1送验样品可为水稻的种子、叶片或其他等效物。送验样品为种子时，其分样和保存应符合GB/T3543.2的规定，种子发芽按GB/T3543.4规定执行。7.1.2用于两系水稻类型检测的送验样品，其纯度应符合GB4404.1的规定。随机抽取至少5粒种子(或5个叶片),分别提取基因组DNA。委托方指定的单株叶片，可直接提取DNA。7.1.3用于两系杂交水稻不育株率鉴定的送验样品，应随机抽取至少100粒种子(或100个单株)分7.1.4以相应标准样品作为对照。将水稻幼苗或叶片约5cm,置于2.0mL离心管中，加液氮用玻棒充分研磨至粉末状；向离心管中加入700μL65℃预热的DNA提取液，65℃孵育1h,每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇混合液，轻缓混匀，室温静置15min;12,000g离心10min,吸取上清液至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min,4℃、12,000g离心10min,弃上清，加入1.0mL70%乙醇洗涤沉淀；.12/000_g,离心，10min后弃去乙醇，室温干燥后加入100μL灭菌水，充分溶解；检测浓度，I用灭菌水将提取的DNA终浓度稀释至-50ng/μ,-20℃保存留用。7.3功能标记检测用附录A中引物对样品DNA进行扩增。PCR扩增反应体系见附录C表C.1和表C.2。反应程序为：95℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,循环35次，72℃5min,4℃保PCR反应完成后，在反应液中加入1～2URsaI酶，推荐反应程序为：37℃孵育4h～16h。47.3.3电泳检测PCR酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳检测(参见附录D)。8带型记录送验样品在检测位点的基因型用扩增片段酶切后长度的变化表示。将送验样品的电泳图谱与相应标准样品进行比较，确定送验样品的各条带分子量。带型数据记录为x/y,其中x,y表示条带有无和分子量大小。对于pms3-M标记，x和y分别代表454bp和369bp位置DNA片段的有无，对于tms5-M标记，x和y分别代表172bp和146bp位置DNA片段的有无，有片段则记录为片段的大小，无片段则记录为0。9结果判定9.1两系水稻类型判定根据附录A表A.1中的功能标记在送验样品中扩增产物的酶切电泳图谱和带型记录，判断不育基因存在与否及其类型(表1)。表1根据带型判定两系水稻类型带型记录不含有pms3和tms5的水稻tms5型杂交水稻主传tms⁵纯合型水稻9.2两系杂交水稻不育株率判定根据两系不育基因功能标记检测结果，两系杂交水稻具有父母本互补带型454/369或(和)172/146,而两系不育株仅具有母本带型0/369或(和)0/146,判定两系杂交水稻中混入的不育株。根据每个受检单株的带型记录，按公式(1)计算受验样品的不育株率：5Nr——供检种子粒数(幼苗数、株数);No——具有0/369(pms3-M)或0/146(tms5-M)带型的种子粒数(幼苗数、株数)。6(规范性附录)A.1功能标记用于两系水稻鉴定的功能标记名称、基因、引物序列、扩增基因正向引物序列(5’—3’)反向引物序列(5’—3”)大小内切酶A.2标准样品的检测结果用pms3-M标记检测pms3基因，扩增产物被RsaI酶切后，阴性标准样品(不携带pms3基因)稻标准样品形成454bp、369bp和85bp的3个片段。用tms5-M标记检测tms5基因，扩增产物被RsaI酶切后，阴性标准样品(不携带tms5基因)样品会出现172bp和146bp的2个片段。HYPERLINK7DB34/T2716—2016(资料性附录)溶液B.11mol/LTris-HCI溶液60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0,定容至500mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。187.6gEDTA-Na₂·2H₂O溶于800mL水中，用NaOH调pH值至8.0,定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。B.3DNA提取液81.7gNaCl和20gCTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL,0.5mol/LEDTA40mL,定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。4℃贮存。B.4氯仿/异戊醇混合液体积比为24:1。B.570%乙醇溶液B.6加样缓冲液2.5mg/mL溴酚兰、40%(m/W蔗糖。aB.8溴化乙锭(EB)贮液10mg/mL溴化乙锭(EB)。8原浓度终浓度dNTPs(每种)下游引物一 原浓度终浓度dNTPs(每种)10证o17下游引物——9(资料性附录)D.1凝胶制备D.1.1pms3-M标记凝胶制备按2.0%(m/v)的琼脂糖浓度配制凝胶。将1×TAE电泳缓冲液和琼脂糖混合煮沸熔化，冷却至55℃~60℃,加入0.01%凝胶体积的溴化乙锭，混匀，倒入已封好的胶槽中，插上样品梳。按4.0%(m/v)的琼脂糖浓度配制凝胶。其他与D.1.1同。D.2加样D.3电泳pms3-M标记电泳约40min,tms5-M标记电泳约1h～1.D.4照相HYPERLINK[1]DingJ,LuaQ,OuyangY,MaoH,ZhangP,YaoJ,noncodingRNAregula