DB12T 506-2014 大豆转基因成分筛查方法

65.020.01B

04

DB12

天津市质量技术监督局发布DB12/T

506—2014前 言本标准按照

GB/T1.1—2009

本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人：黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、陈慧。本标准

2014

年

04

IDB12/T

506—2014大豆转基因成分筛查方法1

范围本标准规定了大豆中转基因成分定性

筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于大豆及其制品中

CaMV35S

启动子、

基因、Bt

bar/pat

基因的定性

筛查检测。2

规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T

672 转基因植物及其产品检测 农业部

2031

号公告—19—2013

农业部

1485

号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA

提取和纯化3

术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin

基因 Lectin

编码大豆凝集素的基因。3.2CaMV35S

启动子

35S

promoter

from

mosaic

（CaMV）来自花椰菜花叶病毒的

35S

3.3NOS

终止子

of

（NOS）

来自胭脂碱合成酶基因

NOS

的终止子。3.4CP4-epsps

基因

derived

from

Agrobacteriumsp.

CP-4。来源于土壤农杆菌株系

（

sp.）

株系一段可编码

5-磷酸合酶的基因。3.5

基因

（

）来源与苏云金芽胞杆菌（

thuringiensis），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、融合基因。3.6bar/pat

基因

resistance

1检测基因引物序列扩增片段长度基因性质Lectinlec-1672F：lec-1881R：210

bp内标准基因CaMV35S35S-F：35S-R：195

bp外源基因NOS：：180

bp外源基因DB12/T

506—2014bar

基因来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces

），pat

基因来源于绿产色链霉菌（Streptomyces

viridochromogens

acetyltransferase，PAT），该酶具有对除草剂草丁膦（）的耐受性。bar

基因和

pat

4

检测方法4.1

试剂和材料4.1.1

GB/T

6682

4.1.2

4.1.3

10

g/L

称取

1.0

g

溴化乙锭（EB），溶于

水中，避光保存。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.4

10

氢氧化钠溶液：在

160

水中加入

80.0

g

氢氧化钠（NaOH到

200

。4.1.5

500

称取

18.6

g

EDTA-Na加入

70

溶液（4.1.4）调

至

8.0

100

。在

103.4

（121

20

。4.1.6

1

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（

称取

g

三羟甲基氨基甲烷（）溶解于

800

至

8.0

1

000

103.4

（121

20。4.1.7

TE

8.0）：分别量取

三羟甲基氨基甲烷-4.1.6

2

乙二铵四乙酸二钠溶液（

1

000

。在

103.4

（121

20

。4.1.8

50×

缓冲液：

242.2

g

300

水加热搅拌溶解后，加

100

乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5

至

8.0

1

。使用时用水稀释成

1×。4.1.9

称取

10

12

h

250.0

二甲基苯腈蓝，用

10

水溶解；称取

50.0

g

蔗糖，用

30

水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至

100，在

4

℃下保存。4.1.10

分子量标准：

50

bp～1

000

bp

的

DNA

片段。4.1.11

混合溶液：

10

的

、、dGTP、

四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12

Taq

25

氯化镁溶液。4.1.13 引物：大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表

1。表1

2CP4-epspsmCP4ES-F：5′-

mCP4ES-R：5′-

GAACAAGCARGGCMGCAACCA333

bp外源基因BtBt-F：5′-

Bt-R：5′-

301

bp外源基因barbar-F：5′-

bar-R：5′-

262

bp外源基因patpat-F：5′-

pat-R：5′-

262

bp外源基因DB12/T

506—20144.1.14

引物溶液：用

缓冲液（）或水分别将上述引物稀释到

10

µDB12/T

506—20144.1.15 石蜡油。4.1.16

4.1.17

提取试剂盒。4.2

仪器4.2.1

分析天平：

0.1

g

和

0.1

。4.2.2

升降温速度>1.5

℃<1.0

℃。4.2.3

电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4

紫外透射仪。4.2.5

4.2.6

4.2.7

其他相关仪器设备。4.3

4.3.1

抽样按

NY/T

672

和农业部

号公告—19—2013

规定的执行。4.3.2

按

NY/T

672

和农业部

号公告—19—2013

规定的执行。4.3.3

试样预处理按农业部

4—

规定的执行。4.3.4

按农业部

4—

规定的执行。4.3.5

4.3.5.1

反应4.3.5.1.1

反应设置

3

4.3.5.1.2 在

反应管中按表

2

25

µL

3试剂终浓度体积水——10×PCR

缓冲液1×2.5

µL25

mmol/L氯化镁溶液1.5

mmol/L1.5

µLdNTPs

混合溶液（各

2.5

mmol/L）各

0.2

mmol/L2.0

µL10

µmol/L上游引物0.1～0.5

µmol/L0.25～1.25

µL10

µmol/L下游引物0.1～0.5

µmol/L0.25～1.25

µL

酶0.025

µL——25

DNA模板2

2.0

µL总体积25.0

µL根据

酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到

µL。如果

PCR

缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积水。注

1

PCR

lec-1672F

和

lec-1672R为

0.2µmol/L；

启动子

PCR

检测反应体系中，上下游引物分别是

和

35S-R，引物终浓度分别为0.4µmol/L；NOS终止子PCR和0.4µmol/L；CP4-epspsPCR和mCP4ES-R0.2µ；Bt

PCR

Bt-F

和

，引物终浓度分别为

0.5µmol/L；

基因和

基因复合

PCR

和

和

pat-R别为

0.1µmol/L。基因名称变性扩增循环次数最终延伸Lectin94

5

min94

30

s58

30

s72

30

s3572

7

minCaMV35S94

5

min94

30

s60

30

s72

30

s3572

7

minNOS94

5

min94

30

s60

30

s72

30

s3572

7

minCP4-epsps95

7

min94

30

s63

30

s72

30

s572

℃，7

DB12/T

506—2014表2

PCR检测反应体系4.3.5.1.3 将

管放在离心机上，

000

g

离心

10

s，然后取出

管，放入

扩增仪中。4.3.5.1.4 进行

反应。反应程序按表

3

表3

PCR反应程序494

30

s60

30

s72

30

s32Bt95

5

min94

1

min56

30

s72

30

s3572

7

minbar

/pat95

5

min94

30

s63

30

s72

30

s3572

7

minDB12/T

506—20144.3.5.1.5 反应结束后取出

管，对

DB12/T

506—20144.3.5.2

反应在试样

以非转基因大豆基因组

DNA

作为阴性对照；以含有

CaMV35S、NOS、、Bt、bar/pat基因的转基因大豆质量分数为

作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照

反应体系中，除模板外，其余组分及

反应条件与

4.3.6

按

20

1×

琼脂糖溶液中加入

5

µL

EB

溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝

1×

12

µL

产物与

3

µL

加样缓冲液

DNA

2

V/cm条件下电泳检测。4.3.7

凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统或紫外透射仪上成像。根据

DNA

分子量标准

扩增片段是否为目的

DNA

片段，按照

和

4.3.9

的规定执行。4.3.8

按

产物回收试剂盒说明书，回收

扩增的

片段。4.3.9

将回收的

、CaMV35S、NOS、CP4-epsps、Bt、bar/pat基因序列（参见附录

A

DNA

片段是否为目的

DNA

5

结果分析与表述5.1

阳性对照的

反应体系正常。否则表明

反应体系不正常，需要查找原因重新检测。5DB12/T

506—20145.2

样品检测结果分析和表述5.2.1 在试样的

反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；而CaMV35S

NOS

Bt

基因、t

基因和

CP4-epsps

基因均未得到扩增，或扩增片段

CaMV35S启动子、NOS

终止子、Bt

基因、bar/pat

5.2.2

反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；启动子、

Bt基因、

基因和

阳性”。6DB12/T

506—2014附录A（资料性附录）A.1

Lectin基因扩增产物核苷酸序列1

GGGTGAGGAT

AGGGTTCTCT

GCTGCCACGG

GACTCGACAT

ACCTGGGGAA

TCGCATGACG61 TGCTTTCTTG

GTCTTTTGCT

CAGTAACATT

GATCCTTTGG121 ATCTTACAAG

CTTTGTGTTG

CATGAGGCCA

ACAGATCGAA

GGAAGAAAGT181 GTAATAAGAC

GACTCTCACT

ACTCGATCGC注A.2

CaMV35S启动子扩增产物核苷酸序列1

GCTCCTACAA

ATGCCATCAT

TGCGATAAAG

GAAAGGCTAT

CATTCAAGAT

GCCTCTGCCG61 ACAGTGGTCC

CAAAGATGGA

CGTGGAAAAA

GAAGACGTTC121 CAACCACGTC

TTCAAAGCAA

GTGGATTGAT

CACTGACGTA

AGGGATGACG181

CACAATCCCA

注A.3

终止子扩增产物核苷酸序列1

GAATCCTGTT

GCCGGTCTTG

CGATGATTAT

CATATAATTT

CTGTTGAATT

ACGTTAAGCA61 TGTAATAATT

AACATGTAAT

TGGGTTTTTA

TGATTAGAGT121 CCCGCAATTA

TACATTTAAT

ACGCGATAGA

TAGCGCGCAA

ACTAGGATAA注A.4

CP4-epsps基因扩增产物核苷酸序列一1

ACGGTGACCG

TCTTCCCGTT

ACCTTGCGCG

GGCCGAAGAC

GCCGACGCCG

ATCACCTACC61

GCGTGCCGAT

GGCCTCCGCA

GCTCGCCGGC

CTCAACACGC121

CCGGCATCAC

GACGGTCATC

GAGCCGATCA

TCATACGGAA

AAGATGCTGC181

AGGGCTTTGG

CGCCAACCTT

ACCGTCGAGA

CGGCGTGCGC

ACCATCCGCC241

TGGAAGGCCG

CGGCAAGCTC

ACCGGCCAAG

GCCGGGCGAC

CCGTCCTCGA301

CGGCCTTCCC

GCTGGTTGCG

GCCCTGCTTG

TTC注A.5

CP4-epsps基因扩增产物核苷酸序列二1

ACGGTGATCG

TCTTCCAGTT

ACCTTGCGTG

GACCAAAGAC

TCCAACGCCA

ATCACCTACA61

GGGTACCTAT

GGCTTCCGCT

GCTTGCTGGT

CTCAACACCC121

CAGGTATCAC

CACTGTTATC

GAGCCAATCA

CCACACTGAA

AAGATGCTTC181

AAGGTTTTGG

TGCTAACCTT

ACCGTTGAGA

CGGTGTGCGT

ACCATCCGTC241

TTGAAGGTCG

TGGTAAGCTC

ACCGGTCAAG

TCCAGGTGAT

CCATCCTCTA7DB12/T

506—2014301

CTGCTTTCCC

ATTGGTTGCT

GCCTTGCTTG

TTC注A.6

基因扩增产物核苷酸序列1

GAAGGTTTGA

GCAATCTCTA

CCAAATCTAT

GCAGAGAGCT

TCAGAGAGTG

GGAAGCCGAT61

CCTACTAACC

CAGCTCTCCG

TCAACGACAT

GAACAGCGCC121

TTGACCACAG

CTATCCCATT

GTTCGCAGTC

AAGTTCCTCT

CTTGTCCGTG181

TACGTTCAAG

CAGCTAATCT

TCACCTCAGC

ACGTTAG