叶绿素荧光分析技术与应用

叶绿素荧光分析技术与应用激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光荧光的发生CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢荧光是研究光能分配的探针将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。由于这个现象最早是由Kautsky发现的，因此有时也被称为Kautsky效应。现已探明，在室温条件下，绿色植物发出的这种荧光信号，绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素蛋白复合体中的叶绿素a分子，荧光发射波长范围约在650－780nm，荧光发射峰在685nm和735nm，其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在438nm与480nm左右。叶绿素荧光诱导动力学是指经过暗适应的绿色植物材料当转到光下时，其体内叶绿素荧光强度会有规律的随时间变化。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线(图1)划分为：O(原点)→I(偏转)→D(小坑)或pl(台阶)→P(最高峰)→S(半稳态)→M(次峰)→T(终点)这几个相(phase)。有时在O和I之间还可辨认出一个扔点称为J相。其中O→P相为荧光快速上升阶段(1－2s)，从P→T为荧光慢速下降(猝灭)阶段(4－5s），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学OIDPSMT曲线经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初相或“O”相，此时的荧光称为固定荧光(F。)，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在Fo处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称为“I”相和“D”相，数秒后荧光强度可达最高点，称为“P”峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P峰即趋于或等于最大荧光(Fm)。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变荧光(Fv)。在P峰之后，植物荧光通常经1－2次阻尼振荡(称较大峰“M1”和“M2”)，才降到接近Fo的稳定的“T”相终水平。荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同，上述荧光诱导动力学过程要延续3—6分钟左右。叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法。非调制式荧光计的结构比较简单，它仅需要一个强连续光源，此光源既作为激发光，又作为测量光，但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点，要求整个系统的时间分辨率达到毫秒(ms)级。在光源与样品之间，通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的，由于发光二极管光源的上升前沿较快，这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管，它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片，以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有A/D转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序，以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收，通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。叶绿素荧光动力学的测量方法TechnicalSpecificationsItemssupplied:Controlunit,remotesendingunit,10darkadaptionleafclips,4AAbatteries,carryingcase,serialcable,downloadingsoftwareandinstructionmanual.Measuredparameters:Fo,Fm,Fv,Fv/Fm,Ft,T1/2Excitationsource:Solidstate685nmsource.Adjustableintensity:500-3000molmsDetectorsandfilters:APINphotodiodewithanIRfilterTestduration:Adjustablefrom2-240seconds.Samplingrate:40Kpointspersecondforfastkineticsforonesecond;switchingto500pointspersecondfortwosecondsandthenswitchingto10pointspersecondfortheremainderofthetest.Digitaloutput:RS232port.Storagecapacity:128kBRAMwithbatterybackup.Supportsupto2,000datasets.Userunterface:Display--BacklitLCD16characterx4lines;Keypad--4x4matrixkeypad.Powersupply:41.5VAAbatteries.Batterylife:Upto15hoursofcontinuousoperation.调制式动力学荧光计至少应具有两束光：调制的弱测量光和连续的强米化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出，测量光中和接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接收器信号的干扰，可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定F。值，经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于10ergs··cm-2·s-1。由于该强度在室温下不足以引起还原态QA的积累，因而荧光强度将始终保持在较低的、恒定的Fo水平上。此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光，植物荧光才迅速上升，并达到P峰，这就是Fv部分，此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似。应该着重指出的是，由于调制式动力学荧光计采用了选频或锁相放大技术，使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光调制信号，而对其他背景光的干扰不放感。TechnicalSpecificationsItemssupplied:Controlunit,remotesensingunit,oneopenframeandfivedarkadaptedleafclips,12V1.2Ahbattery,batterycharger,carryingcase,serialcable,interfacesoftwareandinstructionmanual.Measuredparameters:Fo,Fm,Fv,Fv/Fm,Fs,Fms,Ft,Y,ETR,OptionalclipPARandleaftemperature.Excitationsources:

Saturationpulse:35Watthalogenlampwith690nmshortbandpassfilter.Maximumintensity15,000molmsModulatedlight:660nmLEDwith690nmshortbandpassfilter.Optionalmodulatedlight:450nmLEDsource.Intensityadjustablefrom0to0.4molmsDetectorandfilters:APINphotodiodewitha700-750nmbandpassfilter.Detectionmethod:Amodulatedspectrumsynchronouscarrierlockinamplifier.Samplingrate:Autoswitchingfrom10to1,000pointsperseconddependingontestphase.Testduration:Adjustablefrom2secondsto45minutes.Storagecapacity:Upto2,500datasetsand6tracestotaling45minutesofrecordingsat10pointspersecond体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点：一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分——固定荧光(F。)部分和可变荧光(Fv)部分。固定荧光(F。)代表不参与PSII光化学反应的光能辐射部分；可变荧光(Fv)代表可参与PSII光化学反应的光能辐射部分。因而根据可变荧光(Fv)在总的最大荧光(Fm=Fv十F。)中所占的比例（Fv／Fm)，即可简便地得出植物PSII原初光能转换效率，另一个特点是，荧光动力学是测定植物从暗中转到光下，其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态，直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化，因而它包含着十分丰富的光合信息，这远不是一般静态焚光测量所能比拟的。在体内叶绿素荧光动力学测定中，当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时，PSII原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素。当植物经一段时间暗适应，或用优先为光系统I(PSl)所利用的长波光照射后，其体内PSII的QA和随后的电子受体QB和PQ库等均完全失去电子而被氧化，这时PSII反应中心可接受光电子，即处于“开放”状态，这时荧光强度最弱，即为F。，或处于“O”初始相；当植物被饱和光激发，使PSII电子受体QA、QB和PQ库等完全被还原时，PSII反应中心不再接受光电子，即处于“关闭”状态，这时荧光强度最强，即为Fm，或处于“P”峰相。植物经短暂照光达到“P”峰后，由于一些光合酶系逐渐被活化，使PSI开始运转，而将PSII还原侧的还原态电子受体QA-、QB-和PQH2等再氧化，从而引起荧光强度的猝灭，这称为qQ猝灭；植物在光的持续照射下，紧接着qQ猝灭的增加，在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态。试验证明，它们也可造成荧光猝灭，这种猝灭称为能量猝灭，或qE淬灭。qQ和qE灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。qQ猝灭因为是由QA-等再氧化所造成，因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关；而qE猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起，因而它只与ATP的形成、积累以及与光合膜的状态有关，而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为Q分析，它对于正确理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合参数，特别是与气体交换的关系，是十分重要的，它消除了过去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果，从而为叶绿素荧光动力学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍，这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。根据上述Q分析理论，西德Schreiber博土近年来设计了一种新型的脉冲调制荧光计，该仪器在过去一般调制荧光计的基础上，又增加一束强饱和闪光(≥2000W·cm-2)，它以约5秒一次的频率，与一般段调制荧光计原有的强连续光化光一起，共同照射激发植物样品，以瞬时完全消除qQ猝灭，结果在原来荧光动力学的曲线上，便形成许多叠加的锯齿状荧光脉冲，这样从原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉冲包络线中，就可计算出qQ和qE两个成分。此外，该仪器还具有不怕其他强光源干扰的优点，甚至可拿到光下现场操作。此类荧光计的代表性产品是西德Walz公司生产的叶绿素荧光测定系统(PAM)。(1)compactbasicdevice(2)externalrechargeablebattery(3)batterycharger(4)PC-HP-200(5)specialfiberoptics(6)leaf-clipholderpermitssimultaneousPARand°Cmeasurements(7)externalhalogenlamp(8).darkleafclip(9)distanceleaf-clip(10)separatemicroquantum/temperaturesensor(11)compacttripod,usedtomountbasicdevice,leaf-clipholderandexternalhalogenlamp(12).transportcaseMeasuringlightsource:RedLED,650nm,standardintensity0.1μmolmsPAR;modulationfrequency0.6or20kHz;Auto20kHzfunctionActiniclightsources:RedLED-array,665nm,max.600μmolmsPARandfar-redLED,730nm,max.15WmHalogenlamp:8V/20W,blue-enriched,<710nm,max.8500μmolmsPARwithcontinuousactinicillumination,max.15000μmolmsPARduringsaturationpulsesSignaldetection:PIN-photodiodeprotectedbylong-passfilter(>710nm);selectivewindowamplifier(patented)Measuredparameters:Fo,Fm,Fm',F,Fo',Fv/Fm(max.Yield),F/Fm'(Yield),qP,qN,NPQ,PARand°C(usingLeaf-ClipHolder2030-BorMicroQuantum/Temp.-Sensor2060-M),ETR(i.e.PARxF/Fm')Userinterface:IBM/IBM-compatiblePC(80286upwards)orHP-200/PPalmtopPC;connectionviaRS232,19200baud;keyboardoperation;monitorscreendisplayDataacquisition:ViaPCusingDA-2000softwareDataoutput:DisplayandprintoutviaPC;analogoutput0to2.5VPowersupply:Internalrechargeablebattery12V/1.2Ah,providingpowerforupto500yieldmeasurements;external12Vbattery;BatteryCharger2020-LDimensions:20cmx10.5cmx8.5cm(LxWxH)Weight:2kg(incl.battery)

以反应常数表示三种反应的速度kP光化学反应photo-reactionkF发射荧光

fluorescencekD热耗散

Energydissipation荧光产额可表示为：ΦF=kF/(kF+kP+kD)。光合量子产额可表示为：ΦP=kP/(kF+kP+kD)热耗散产额可表示为：ΦD=kD/(kF+kP+kD)PSII作用中心完全开放时，kP最大，kF最低，此时的荧光称为初始荧光Fo;PSII作用中心完全关闭时，kP=0，kF最大，此时的荧光称为初始荧光Fm;Fm与Fo之差（Fm-Fo=Fv)是因为光化学反应进行而猝灭的荧光，称为可变荧光Fv.显然，光化学反应的最大潜能可表示为：ΦP=(ΦFm-ΦFo)/ΦFm=(Fm-Fo)/Fm=Fv/Fm

Fv/Fm是反映光合效率的重要指标

分析：Fm下降、Fv/Fm下降、Fo上升的原因叶绿素荧光动力学的生物学意义

荧光参数的意义Fv/Fm

最大光化学效率ΦPSII=(Fm’－Fs)/Fm’PSⅡ实际光化学效率Fv’/Fm’PSⅡ最大天线转化效率P=ΦPSII×PFD

光化学反应速度NPQ＝Fm/Fm’－1

非光化学猝灭qp=(Fm’－F)/(Fm’－F0)光化学猝灭系数qN=(Fm’－F0’)/(Fm－F0)非光化学猝灭系数D=1－Fv’/Fm’

吸收光能通过热耗散消耗的部分Fo：固定荧光，初始荧光(minimalfluorescence)。也称基础荧光，0水平荧光，是光系统II(PSII)反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。Fm：最大荧光产量(maximalfluorescence)，是PSII反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映通过PSII的电子传递情况。通常叶片经暗适应20min后测得。F：任意时间实际荧光产量(actualflourescenceatanytime）Fa：稳态荧光产量(fluorescenceinstablestate)。Fm/Fo:用来反应PSII的电子传递情况。Fv＝Fm-Fo:为可变荧光(variablefluorescence),反映了QA的还原情况。Fv/Fm:PSII最大光化学量子产量(optimal/maximalphotochemicalefficiencyofPSIIinthedark)或(optimal/maximalquantumyieldofPSII)，反映PSII反应中心内禀光能转换效率(intrinsicPSIIefficiency)或称最大PSII的光能转换效率(optimal/maximalPSIIefficiency)，叶暗适应20min后测得。非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。

Pv’/Fm’：PSII有效光化学量子产量(photochemicalefficiencyofPSIIinthedark)，它反映开放的PSII反应中心原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。(Fm’－F)/Fm’或ΔF/Fm’：PSII实际光化学量子产量(actualphotochemicalefficiencyofPSIIinthelight)，它反映PSII反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。荧光猝灭分两种：光化学猝灭和非光化学猝灭。光化学猝灭：以光化学猝灭系数代表：qP＝(Fm’－F)/(Fm’－Fo’)；非光化学猝灭，有两种表示方法，NPQ＝Fm／Fm’－1或qN＝1－(Fm’－Fo’)/(Fm－Fo)＝1—Fv’/Fv。表观光合电子传递速率：[(Fm’－F)Fm’]×PFD，或ΔF/Fm×PFD×0.5×0.84，其中系数0.5是因为一个电子传递需要吸收2个量子，而且光合作用包括两个光系统，而系数0.84表示在入射的光量子中被吸收的占84％，PFD是光子通量密度；相应表观热耗散速率以(1—Fv’/Fm’)×PFD表示。Fmr：可恢复的最大荧光产量，是在荧光P峰和M峰后，当开放的PSII最大荧光产量平稳时，关闭作用光得到Fo’后，把饱和光的闪光间隔期延长到180s/次，得到一组逐渐增大(对数增长)的最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴的截距即为Fmr。以(Fm－Fmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化学淬灭产率，即发生光抑制的可能程度。Fv/Fo和Fv/Fm分别代表PSII的潜在活性和PSII原初光能转化效率。光抑制条件下Fv的降低主要是由于Fm的降低，不是Fo增加的结果。非光化学能量耗散易造成Fo的降低，而光合机构被破坏又使其升高，所以该参数的变化趋势可以反映引起这种变化的内在机制。光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能用于光化学电子传送的份额，要保持高的光化学猝灭就要使PSII反应中心处于“开放”状态，所以光化学猝灭又在一定程度上反映了PSII反应中心的开放程度。光化学猝灭反映了PSII原初电子受体QA的还原状态，它由QA重新氧化形成。光化学猝灭系数qP愈大，QA重新氧化形成QA的量愈大，即PSII的电子传递活性愈大。对小麦的研究表明，水分胁迫使得qP变小，证明从PSII氧化侧向PSII反应中心的电子流动受到抑制。非光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分。当PSII反应中心天线色素吸收了过量的光能时，如不能及时地耗散将对光合机构造成失活或破坏，所以非光化学猝灭是一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用。目前我国对农作物抗逆性包括抗寒性和抗热性的检测和鉴定，基本是靠各地田间多年观察和对比的资科中得出来的，这种田间鉴定方法周期长、工作繁重，而且由于田间栽培和气象条件的经常变化，给鉴定结果带来误差和工作困难，因此在生产和研究上都迫切需要一种能快速、简便和科学地检测和鉴定植物抗逆性包括抗寒性和抗热性的技术。八十年代初以来，人们在逐渐弄清植物体内叶绿素荧光动力学与光合作用关系的基础上，发现它对外界各种胁迫因子均十分敏感，因而有可能将它作为植物理想的各种抗逆性的指标和技术。目前国外有关研究论文越来越多，其中以用荧光动力学鉴定植物抗寒性方面的研究开展得最早，也较为深入。叶绿素荧光动力学的应用1.在鉴定植物抗寒性和抗热性中的应用澳大利亚Smillie等首先将检测植物抗寒性的荧光动力学方法规范化。他们先将待测植物的叶片置于0℃下，经不同时间预处理后，仍在0℃下快速检测其荧光动力学。发现样品荧光最大上升速率(RF)(实际为可变荧光最大上升速率)下降为未经0℃处理的对照叶片RF的50%时所需的0℃处理时间(C0T0)，作为该植物或品种的抗寒性的相对量度。抗寒性的参数(C0T0)可在不同次试验和不问植物之间进行比较。用此方法对黄瓜、玉米、大豆、番石榴、芒果和葡萄等的抗寒性进行了比较，均获满意结果。不足之处是该方法仅局限于对低沉敏感和中等抗冷的植物，而对许多能忍受0℃以下的抗冻植物则不太适用。随着低温处理时间的延长，最不抗冷的88—9005品种经24小时0℃处理后，其M峰最先消失，荧光猝灭也最早趋干0。而最抗冷的84－15品种，则要经72小时0℃处理，其M峰才逐渐消失，而其荧光猝灭的完全抑制，则要90小时。说明光合作用暗反应，特别是PSII还原侧的电子流受到抑制。此外，对低温敏感的品种，其P峰和Fv随着低温处理时间的延长而更迅速地减少，这说明其PSII和放氧侧更易受到低温的损伤。除了RF外，叶绿素荧光动力学的其他一些参数(如M峰、P峰、Fv及荧光猝灭等)，均可综合作为鉴定植物(品种)抗冷性的指标。水稻抗寒性鉴定林世青等用调制式荧光计研究和检测几种不同水稻品种的抗冷性与叶绿素荧光动力学的关系。先将被试水稻幼苗放在0℃暗中处理不同时间(24－90小时)，观察不同品种荧光动力学曲线随低温处巡时间的变化过程。小麦抗寒性鉴定

用非调制式荧光计，每隔十天左右，检测和比较六个已知其抗冻性顺序的冬小麦品种在北方自然条件下越冬过程中叶绿素荧光动力学的变化。结果表明，只有经过冬季低温锻炼，不同品种抗冻性的差别才能通过荧光动力学有规律地表现出来。到了第二年春季土壤开始解冻小麦开始返青之时，不同品种之间的荧光动力学曲线表现出最显著的差异。可变荧光猝灭(ΔFv/F。)和可变荧光猝灭速率(ΔFv/T)与小麦品种抗冻性之间有极好的相关性，它们均随着品种抗冻性的减弱呈梯度下降。荧光上升曲线互补面积(CA/Fo)与抗冻性的相关性也较好,即抗冻性越强，其CA/Fo越大，ΔFv/Fo和ΔFv/T反映光合电子传递及传递速率和光合膜的能态化及能态化速率的总和，而CA/Fo反映PSII电子受体库的大小。这三个荧光动力学参数在不同抗冻性小麦品种中呈现出有规律的梯度变化，表明它们是冬小麦在低温冷冻下其光合膜最容易受到损伤和抑制的部位。认为植物经充分低温锻炼后，其ΔFv/Fo、ΔFv/T和CA/Fo均可综合作为植物抗冻性的生理指标。林世青等于早春从田间取常绿阔叶树枝条和叶片材料放在控温低温箱中，经一昼夜最低温度为－18℃和－22℃的两种程序降温预处理，并各在上述两种最低温度下保持5小时，逐渐回到室温，后用荧光动力学方法检测它们叶片和枝条的不可变荧光(Fv)存留情况，作为该树种(器官)存活的指标。结果用荧光动力学所测得的结果，与田间越冬观察结果完全一致。并将此用于胶东卫茅(Euonymuskiantschoricus)、构骨(Tlex

cornnta)、女贞(Ligusirum

lucidum)、刺桂(Osmanthusheterophyllus)和蚊母(Distylicumracemosum)的抗寒性鉴定。Havaux用脉冲调制式荧光计测定了28个品种、变种的甜高粱和苏丹草的抗寒性及其遗传变异。发现可以用经3℃处理后叶片稳态荧光qQ猝灭的下降作为鉴定它们抗寒性的指标。qQ

猝灭的下降与非循环式光合电子传递速率以及放氧速率的减少直接相关的。抗热性鉴定采取与检测植物抗寒性相似的方法，将待检测的植株或其枝条、叶片，放在选定的不同高温下预处理，观察其荧光动力学的变化。用调制式荧光计，在仅用一束弱的测量光情况下，连续监测和记录固定荧光(Fo)随样品温度程序梯度上升时所形成的拐点，该拐点是光合膜开始受高温损伤的标志，也是该植物(品种)能够忍受最高温度的临界点。干旱和盐碱对植物产生的胁迫作用有着共同的生理基础，它们均引起植物失水和体内渗透压的增加．从而影响植物代谢和光合作用的正常进行。后者还伴有盐代谢失调等问题。植物水分亏缺会立即对植物光合作用起抑制作用，盐代谢失调迟早也会对光合功能产生不良的影响。体内叶绿素荧光动力学对植物水分亏映和盐碱危害均十分敛感，是一种理想的监测手段。2.在检测植物抗旱性和抗盐性中的应用林世青等用小麦叶片为材料，经不同程度干燥失水后，用毫秒荧光计测定体内叶绿素荧光动力学的变化。叶片缺水增加，其荧光猝灭(ΔFv＝Fm－F）迅速减少，说明光合电子传递和膜的能态化逐渐受到缺水的抑制，从D-3曲线开始，ΔFv就几乎接近于零。荧光猝灭(ΔFv)是十分灵敛的监测植物缺水的参数，它的变化远出现在植物开始呈现萎蔫之前。随着失水的加剧，叶片可变荧光(Fv)也随着减少，说明PSII的结构与功能受到不同程度的损伤与破坏。Schreiber等用脉冲调制式荧光计测定一种浆果鹃属植物(Arbutusunedo)的叶片在不同失水状态下体内叶绿素荧光两个猝灭成分qQ和qE变化的规律。随着叶片含水量的降低，其qQ猝灭与放O2速率几乎同步下降，但qE猝灭在一定失水范围内有所增加。对于植物抗盐性的鉴定，林世青等用不同盐浓度水培的玉米和小麦幼苗为材料，以50％植株的荧光猝灭ΔFv趋于零时培养液的盐浓度作为该植物最大耐盐浓度的指标，该指标与品种的致死盐浓度的阀值密切相关。均三氮苯类除草剂：阿特拉津、敌草隆[3-[3，4-二氯苯基)-l，1-二甲基脲，DCMU］等是国内外常用的一类除草剂。为了扩大它们在不同农作物中使用范围和提高其使用的安全，已成功地将阿特拉津抗性基因从对它具抗性的植物中转导到原来对它敏感的植物上，从而使后者获得了对阿特拉律的抗性。在这项基因转导工作中，我国和外国学者均利用叶绿素荧光动力学技术，作为鉴定植物是否具有抗阿特拉律基因（psbA)的一种简便的，灵敏的和专一的探测手段。DCMU类化合物之所以能够选择性地杀死某些植物，是由于它能专一地、非共价地结合于这些植物叶绿体中的PSII电子受体QB上，从而使光合链中的电子从QA向QB的传递受到抑制，这种抑制作用又大大促进植物在光下的光抑制，从而使植物加速死亡。一些对它不敏感的植物，在它们的与QB结合的D1蛋白质的psbA基因中改变了一个核苷酸，使由此基因合成的D1蛋白质不受DCMU的攻击，因而这些植物就不受这类除草剂的影响。3.在筛选抗除草剂植物遗传工程的应用这两类对DCMU敏感性不同的植物在喷施DCMU类除草剂之后，其体内叶绿素荧光动力学表现出显著的差异。如经100μmol/LDCMU处理后，抗DCMU的龙葵叶片荧光上升曲线明显慢于对DCMU缺感的甘薯叶片的荧光上升曲线(曲线1)，因而使龙葵的荧光上升互补面积（CA，曲线1的阴影部分）明显大于甘薯的CA。CA代表PSII受体侧电荷库的大小，因而它与DCMU抑制程度呈负相关，根据经DCMU处理之后CA减少的百分比，即可作为鉴定植物是否具有抗DCMU类除草剂基因的专一指标。除了用快速荧光上升互补面积[CA)作为鉴定抗DCMU类除草剂的指标外，还可用慢速调制荧光动力学中的荧光猝灭(ΔFv)的程度来判断。这是因为对除草剂敏感的植物，由于QA－→QB的电子传递被抑制；使QA再氧化十分困难，结果荧光猝灭受抑制，荧光强度便始终保持在接近Fm的水平；而抗除草剂的植物，其荧光猝灭正常，在一般正常情况下，其稳态终相(FT)荧光强度将下降到接近Fo的水平，因而两者在稳态终相荧光强度，尤其是在荧光猝灭程度方面，就显出很大的差别。这种以荧光猝灭程度为基础的植物抗除草剂鉴定法对测定仪器的要求较简单，甚至用一般的(慢速的)荧光光度计即可。但是当核物样品稍保管不善也会因受胁迫而引起荧光猝灭不同程度的抑制，因此该方法显然不如CA法那么专一。此外。林世青等用体内叶绿素荧光动力学方法证明了从龙葵中得到的抗阿特拉津psbA基因，不仅可导入原来对除草剂敏感的大豆叶绿体的基因组中获得表达，而且还能将抗阿特拉律psbA基因遗传给后代。Ronger和Graber等建议，用快速荧光动力学上升曲线的缓台阶(I和D相)对Fm的相对高度，来研究除草剂从叶片表面渗入到叶片细胞叶绿体中作用部位的过程，以及研究除草剂在体内去毒分解的过程。这将有助于改进除草剂的分子结构、剂型及组成。贮藏保鲜的实质就是降低植物代谢水平，以延经植物的衰老和抑制果实的后熟过程。在实际工作中，人们常采用低温贮藏和气调技术。林世青等用叶绿素荧光动力学技术，监测香蕉果实在不同温度贮藏下的后熟过程；以广东产的未完全成熟的绿色香蕉为材科，分为四组，分别置于o、6、12和25℃温度下，经不同时间(1－13天)贮藏后，用慢速调制式荧光计检测香蕉果皮叶绿素荧光动力学的变化及其与果实外观变化的相关性。0℃l天贮藏后，果皮的M峰即消失，此时果皮虽仍为绿色，但已将会出现冷害的征兆。随着在0℃下贮藏时间的延长，其F峰也逐渐消失，可变荧光(Fv)也随之下降，到了第10天，果皮变为深褐色，说明冷害已加重，并充分表现出来，其商品价值也因而受到影响；在6℃下贮藏的香蕉，其果皮M峰到第10天开始消失，说明它也开始出现冷害，第13天果皮显出褐色；在25℃下贮藏的香蕉，M峰第5天开始消失，此时果皮已开始发黄，说明过高的温度促进了后熟和老化；唯有在12℃下贮藏的香蕉，经10天贮藏后其果皮仍呈现正常的OPSMT荧光动力学曲线，说明12℃是香蕉冷藏保鲜的最适温度。由此可见，叶绿素荧光动力学可以跟踪水果蔬菜(只要仍含有微量叶绿素)在贮藏过程中的生理变化，预测冷害和早衰，以帮助人们选择最佳的贮藏保鲜条件。4.在水果蔬菜贮藏保鲜中的应用林世青等用叶绿素荧光动力学等方法，研究了SO2对几种园林植物的作用。比较了大叶黄杨、小蘖和五角枫在经过4小时SO2（4和8ppm）通气处理后，它们第2天的叶绿素荧光动力学的变化。经4ppmSO2处理后，这3种园林植物的荧光动力学均发生显著的变化：M峰均已消失，且M峰的下降和消失发生在植物外表出现SO2伤害症状之前；可变荧光对固定荧光的比值(Fv/F。)比各自的对照均明显下降，如大叶黄杨降为67.5％，五角枫和小蘖仅分别为对照的25.3%和49.5%，说明它们的PSII受到一定程度的损伤。若SO2浓度为8ppm，则五角枫和小蘖的可变荧光(Fv)均完全消失，说明PSII的功能已完全丧失，而此时大叶黄杨还残留一点可变荧光。由此推测，大叶黄杨比前两种有较强的抗SO2的能力，这与用其他方法检测的结果完全一致。5.在监测植物对环境污染反应中的应用一个作物品种增产潜力的大小归根到底是由它的遗传基因所决定。在完全满足植物生长诸条件时，植物的生物产量和农业产量将主要由生长过程中光合产物的形成和积累乡少所决定，而后者又取决于光合作用的光能转换效率。由于叶绿素荧光动力学可简便地用可变荧光对最大荧光的比值(Fv/Fm)检测FSII原初光能转换效率，因而可能成为早期预测作物增产潜力的有效手段。林世青等首次运用此技术对近30个水稻品种进行了苗期荧光动力学检测。结果表明不同水稻品种苗期叶片的Fv/Fm和Fv/Fo，均与该品种的产量水平成正相关，符合率高达93%，因而可考虑作为快速、简便地预测作物增产潜力的一种相对的生理指标。6.在苗期预测作物增产潜力中的应用产量水平较高的品种(如中系8514、8541)，Fv/Fm和Fv/Fo都较高；产量水平较低的品种(如中系8240)，其对应荧光比值也较低。t测验表明，它们之间差异均达到非常显著的程度。迅速了解海洋浮游植物和陆上农林收等植被大面积分布和生长情况，以及各种因子对它们长、短期的影响，目前最理想的方法就是应用飞机或卫星遥感遥测地面(植物)对不同光谱波段的反射强度及其变化。1978年，美国首次发射一颗载有专门遥测海岸地区浮游植物的光谱颜色扫描器的人造卫星(NIMBUS7)，其工作原理是：海水中浮游植物的浓度增加，则会使海水的颜色从蓝色变为绿色，然后根据扫描器中蓝色对绿色光谱辐射通道强度比值的变化，就可计算出浮游植物的含量。但是，在海水中特别是在海岸边和海口区的海水中常含有大量的其他悬浮颗粒和有机物，由于它们对光线的放射和吸收作用，也会使海水颜色产生类似的变化，而造成严重的假象和误差。为了克服这个缺点，Neville和Gower首先发现和提出，可将浮游植物体内叶绿素荧光经海水向上散射而在685nm波长附近形成的椭圆形辐射小峰，作为专一遥测海洋浮游植物的指标。Doerffer首先应用该指标，从600nm飞行高度的飞机上，成功地绘出了北海海岸90km长、水深2m以内的浮游植物平面分布图，其遥测结果与地面实测数据极为吻合(r＝0.98)。7.在遥感遥测海洋和陆地植物中的应用在陆地上由于植物叶片中叶绿素合量比海水高好几个数量级，使植物荧光强烈被自身再吸收，结果荧光强度反而随着叶绿素含量的增加而下降。Lichtenthaler根据植物对体内叶绿素的两个荧光峰中较短波长F690比对较长波长的F735的荧光吸收更强烈，因而建议用这两个荧光峰的比值(F690/F735)作为专一遥测陆上植物数量的指标。同时，他还根据植物受环境胁迫后总是普遍引起叶绿素合成和积累的下降以及叶绿素含量的降低，从而均减少荧光的自吸收和造成F690/F735比值的增加，提出用F690/F735比值作为植物对环境胁迫反应的指标。Zimmermann和Guenther于1986年首次成功地用以激光为光源的改良式海洋学激光雷达飞机系统首次进行了森林植被的航空遥测，证实了Lichtenthaler提出的体内叶绿素的两个荧光峰比值(F690/F735)可以作为专一遥测森林健康状况的指标。该系统除了对植物具专一性外，与前述被动地以太阳为光源的系统相比，它还具有不受太阳和气候条件的限制，可昼夜工作，以及可减少或避免云雾的干扰，可获得具有较佳的信噪比信号。Liehtenthaler和Bertolini等考虑到常规的毫秒级荧光动力学难以满足遥测中地面快速扫描的要求，提出试用皮秒(10-12秒)级超快荧光计测定体内叶绿素荧光寿命的变化，作为专一遥测植物的另一种可能选择。该方面研究仍处于探索阶段。西德已制成一种新型机载激光雷达遥测系统，它采用准分子激光泵浦的染料激光器作为光源，用装有特殊通道的高斯望远镜作为接收器，整个系统安装在一架多尼尔研究飞机上。据介绍该系统具有以下多种遥测功能：通过遥测海水中叶绿素荧光，可了解浮游植物的含量和分布；通过遥测海水中有机物的荧光，从而获得海洋污染物的分布情况、污染程度和石油泄漏情况等；还可遥测海洋流体动力相互作用和淡、咸水混合过程等，因而是研究海洋生物学、海洋学和检测海水污染的一种新型有力的手段。1植物在发育过程中光合能力不断发生变化，这种变化是由光能吸收转化效率造成的还是由碳同化能力改变造成的？2植物叶片衰老过程中，光合作用光反应过程和碳同化能力都降衰退。哪个过程是限制因素？3如果碳同化能力下降快，必定导致过剩光能增多，光抑制和光破坏的危险增大；如果衰老过程是由叶绿素降解造成的，就会使光合机构捕获的光能也减少，造成过剩光能的可能性降低，此时还能否光抑制和光破坏？4如果衰老到一定程度时，导致PSⅠ和PSⅡ都降解，或是导致电子传递链中的主要成分质体醌和Cytob-f复合体丧失，那么光反应产物就会减少，这时植物是否还会产生较多的过剩光能？或许会因为电子不能顺利传递导致激发态的叶绿素直接与溶液中的分子O2作用形成1O2，对植物造成更大的破坏。5.衰老植株对逆境变得更为敏感，是否光能耗散机制也同样变得敏感。如果是这样的话，衰老植株在逆境胁迫下由于过剩光能的增加，以及耗散光能的能力下降，就会导致严重的光破坏，这是否也是逆境胁迫加速衰老的一个原因呢？8.在作物光合功能研究中的应用几个重要概念光抑制强光造成光合功能下降的过程称为光抑制特征：光合效率下降；Fv/Fm及AQY下降

过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。甚至把光抑制、光破坏、光漂白、光氧化等概念通用。

XPheoQ

FdPQ

NADP

CytfO2

PCP700光量子H2O

ZP680光量子

光合电子传递链光破坏当过剩的光能不能及时有效地排散时，对光合机构造成不可逆的伤害，如对光合色素造成光漂白、光合作用中心D1蛋白的降解及光合机构的光氧化等。3P680+O2P680+1O2氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PSⅡ反应中心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PSⅡ受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。Fd－+O2

Fd+O2·－O2。－启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统失活。P680++

β－CarP680

+

β－Car+PSⅡ受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。一切影响CO2同化的外接界因素如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，、导致过剩光能增加，进而加重光破坏。激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光光破坏防御机制CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢1减少对光能的吸收

●

增加叶片的绒毛、蜡质

●减少叶片与主茎的夹角2增强代谢能力

●

碳同化

●光呼吸与活性氧清除系统

●氮代谢

●Mehler反应与活性氧清除系统3

增加热耗散

●依赖叶黄素循环的热耗散强光

紫黄质环氧玉米黄质玉米黄质弱光

●

作用中心可逆失活

●状态转换

热耗散过程虽然能耗散过剩光能,保护植物不被强光破坏,但却不可避免地降低了光化学效率,按传统的观点凡是导致光化学效率降低的过程都称为光抑制。由此可见,光破坏的防御机制也是光抑制的一种形式,实际上在自然条件下,大多数的光抑制都是由光破坏防御机制造成的。大豆研究成果：1、叶片从伸出到展开过程，首先完善起来的是光能吸收、转换及耗散机制，随后再逐渐完善气孔功能和利用同化力还原CO2的能力。

大豆叶片从伸出到展开过程光合速率的相对值大豆叶片从伸出到展开过程气孔导度的相对值大豆叶片从伸出到展开过程气孔限制值相对值大豆叶片从伸出到展开过程最大光化效率相对值大豆叶片从伸出到展开过程NPQ相对值

2.大豆叶片在衰老过程中，光合能力、羧化效率、表观量子效率、叶绿素及类胡萝卜素含量、Chla/b都逐渐下降，但是PSⅡ最大光化学效率在整个生育期基本维持恒定。在整个生育期光合作用暗反应是决定大豆光合速率高低的关键因素。田间大豆不同节位叶片在生长发育过程中光合速率的变化田间大豆不同节位叶片在生长发育过程中光合能力（A350）的变化田间大豆不同节位叶片在生长发育过程中羧化效率的变化田间大豆不同节位叶片在生长发育过程中AQY的变化田间大豆不同节位叶片在生长发育过程中叶绿素含量的变化田间大豆不同节位叶片在生长发育过程最大光化学效率（Fv/Fm）的变化田间大豆播种后第71天第4～11节位叶片的Pn、CE、Chl及Fv/Fm的变化3.在光合衰退过程中，光饱和时的光合速率及光饱和点的下降幅度显著大于CO2饱和时的光合速率及CO2饱和点的下降幅度，A350/Jmax逐渐下降，说明光合暗反应过程的衰退幅度大于光反应过程的衰退幅度。

●

A350

是气孔阻力为零、光饱和时的光合速率，反映光合暗反应能力的大小。

●

Jmax是Ci饱和时的光合速率，反映光反应电子传递能力的大小。●

A350/Jmax的变化是反映光合作用光、暗反应相对变化的指标

不同生育期田间大豆倒数第一片展开叶Pn对PAR、Ci及Ca的响应田间大豆第9位叶片展开后第5、30、41、51天时Pn-PAR、响应曲线田间大豆播种后71天第5，7，9，11节位叶片的Pn－Ci响应曲线

4.

依赖叶黄素循环的热耗散在大豆光抑制及光保护中的作用

●

随着光强的增加，老叶和幼叶的光化学效率逐渐降低，老叶的下降幅度大于幼叶。光化学效率的下降是由热耗散增加造成的。

●抑制了叶黄素循环中玉米黄质的形成后，热耗散的增加受到抑制。说明大豆非光化学猝灭过程主要是依赖叶黄素循环的热耗散过程。

大豆老叶和功能叶ΦPSⅡ及NPQ对光强的响应DTT处理后大豆功能叶与老叶NPQ对PAR的响应DTT处理前后大豆功能叶与老叶NPQ对PAR的响应的比较由弱光转到强光下，幼叶的Pn、Gs、φPSⅡ及NPQ都能在较短的时间达到最大值，老叶需要的时间要长得多。在没有逆境胁迫下，数小时的持续强光不会对大豆光合机构造成破坏结荚期大豆功能叶和老叶Pn、Gs、对强光的响应由黑暗转入强光后，不同叶龄大豆叶片φPSⅡ、NPQ、Fm’