色谱分析（分析化学课件）

色谱分析基本概念1906年，俄国植物学家茨维特对植物叶的色素进行研究时，使用左图装置：将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙直立的玻璃管，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分相互分离形成各种颜色的谱带。这种分离物质的方法因此得名为色谱法。

玻璃柱内的填充物碳酸钙称为固定相(stationaryphase)，冲洗剂石油醚称为流动相（mobilephase）

20世纪色谱法迅速发展。30与40年代相继出现了薄层色谱法和纸色谱法，与原有的柱色谱法一并统称为经典液相色谱法，使色谱法成为一门分离技术；

色谱法是一种物理或物理化学分离分析技术。色谱分析基本概念一、色谱过程：

色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，其中一项是固定不动的，称为固定相（stationaryphase）；而另一相则是携带试样向前移动的流动体，称为流动相（mobilephase）。

色谱过程物质在这相对运动的两相间达到分配平衡的过程。色谱分析基本概念（一）分离原理：吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分配系数不同→差速迁移→分离分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异。微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出。色谱分析基本概念K值越大，流速慢，tR越长，即后流出色谱柱；K值越小，流速快，tR越短，即先流出色谱柱；当色谱分离原理不同时，分配系数K的含义也不相同。在吸附色谱中，

K为吸附系数；在分配色谱中，K为分配系数；在离子交换色谱中，K为交换系数；在凝胶色谱中，K

为渗透系数。（二）分配系数K指在一定的温度和压力下，某组分在两相间的分配达到平衡时的浓度的比值。

色谱分析基本概念（三）分配系数与保留时间的关系

不同组分有不同的分配系数。K值越大，平衡时该组分在固定相中的浓度越大，移动速度越慢，tR越长，即后流出色谱柱；K值越小，平衡时该组分在固定相中的浓度越小，移动速度越快，tR

越短，即先流出色谱柱；由此可见，混合物中各组分在两相的的分配系数不同时，就能实现差速迁移，分配系数相差越大，越容易分离。色谱分析基本概念

二、色谱法的特点：

（一）分离效率高

：复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。（二）灵敏度高：可以检测出

g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。

（三）分析速度快：一般在几分钟或者几十分钟内可以完成一个试样的分析。（四）应用范围广：

气相色谱：沸点低于400℃、结构稳定的各种有机或者无机试样的分析。

液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

色谱分析基本概念色谱分析的分类一、按流动相的状态分类：1.液相色谱：流动相为液体（称为淋洗液）；2.气相色谱：流动相为气体（称为载气）；3.超临界流体色谱法：流动相为超临界流体；4.毛细管柱色谱法：流动相为缓冲溶液。二、按色谱过程的分离机制分类：1.吸附色谱法：吸附剂作固定相，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差异进行的分离分析方法。2.分配色谱法：液体作为固定相，利用不同组分在互不相溶的两溶剂中的分配系数（或溶解度）的差异进行的分离分析方法。色谱分析的分类3.离子交换色谱法：离子交换剂作固定相，利用离子交换剂对不同离子的交换能力的差异进行的分离分析方法。4.分子排阻色谱法：凝胶（或分子筛）作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分有不同的阻滞作用（或渗透作用）进行分离分析的方法。色谱分析的分类三、按操作形式分类：1.柱色谱法：将固定相装于柱管内构成色谱柱，分离过程在色谱柱内进行。2.平面色谱法：包括薄层色谱、纸色谱法、薄膜色谱法。分离的过程在固定相构成的平面状层内进行的。3.毛细管电泳法和电色谱法：分离过程在毛细管内进行的。色谱分析的分类1、薄层板的制备在制备吸附薄层色谱中，固定相的选择十分重要。其选择应从两个方面考虑：①被分离物质的性质（如极性、酸碱性、溶解度等）②吸附剂吸附能力的强弱。若被分离物质极性强，应选择吸附能力弱的吸附剂；若被分离物质极性弱，应选择吸附能力强的吸附剂。薄层色谱测定步骤吸附剂就其性质而言，可分为有机吸附剂（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、磷酸镁和硅酸钙镁等）。最常用的是氧化铝和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。常用的吸附剂厚度为0.5～2.5mm，色谱板的尺寸一般为20cm×20cm或20cm×40cm。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离的样品量。1.0mm厚的硅胶板最多可上样5mg／cm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。薄层色谱测定步骤2、流动相（展开剂）的选择选择展开剂主要是由被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来决定.①一般先选择单一溶剂作展开剂；对难分离组分，则需要使用二元、三元甚至多元的溶剂；②先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，直到选出合适的展开剂组合为止。

薄层色谱测定步骤

③对普通酸性组分：特别是离解度较大的弱酸性组分应在展开剂中加入一定比例的酸，可防止拖尾现象；④对于碱性物质：如某些生物碱，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展开剂为宜；但对某些碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂。理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大。各组分理想的比移值在0.2-0.8之间。薄层色谱测定步骤3、点样

①选用挥发性溶剂(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)；②最好用与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂能迅速挥发，以减少色斑的扩散。水溶性样品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。薄层色谱测定步骤

点样示意图反应混合液样1-2cm点样直径≤2mm1cm≤点间距≤1.5cm原料样薄层色谱测定步骤

③注意事项：A样品的浓度应在5％～10％左右。点样带应尽可能狭窄，以获得更好的分离效果。溶解样品的溶剂要尽量避免用水；B适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样过少，不易检出。一般是几微克到几十微克；C尽量用小的点样管，如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。薄层色谱测定步骤4.展开展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。薄层板呈倾斜状。盖上盖子，容器密闭。防止边缘效应。薄层色谱测定步骤5.显色常见的显色方法：①物理显色法②生化显色法③化学显色法

薄层色谱测定步骤6.样品的收集在确定色带位置后，可用刮刀或一与真空收集器相连的管形刮离器将该色带吸附剂从板上刮下。后一种方法并不适用于敏感的物质，因吸附剂持续与气流接触，所含的纯化合物有被氧化的危险。薄层色谱测定步骤注意：A无论采用何种回收方法，都应以极性尽可能小的溶剂将化合物从吸附剂中提取出来(1g吸附剂约使用5mL溶剂)。B化合物与吸附剂接触的时间越长，被破坏的可能性越大。可先用4型玻璃砂芯漏斗过滤洗脱液，然后再用孔径为0.2～0.45μm的滤膜过滤。C甲醇可溶解硅胶及其中含有的一些杂质，因此，并不适用于从吸附剂上洗脱被分离的化合物，较合适的溶剂是丙酮、乙醇或氯仿。薄层色谱测定步骤薄层色谱定量分析方法定量分析：1、间接定量法：

将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再借助分光光度法、HPLC法或者GC法对该洗脱物质进行定量分析；2、直接定量法：

（1）斑点面积测定法：以半透明纸扫TLC图上的斑点界限，然后测定其面积。将斑点面积同平行操作的标准样品面积进行定量；（2）目测法：

将被测样品和标准系列溶液点在同一薄层板上，显色后，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列相比较，可推测样品的含量范围。该方法适用于对常规大量样品的重复分析。

现薄层扫描仪定量是薄层色谱定量的主要方法：用一定波长、一定强度的光束照射到薄层板上被分离组分的色斑上，用仪器进行扫描后，求出色斑中组分的含量。薄层色谱定量分析方法

薄层色谱又称薄层层析（ThinLayerChromatography）：是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。常用TLC表示。属于固-液色谱的一种。分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）；特点：分析快速、灵敏、显色方便；应用：中药成分的鉴定和药物杂质检查。

薄层色谱法概述分离原理：

吸附薄层色谱是应用最广泛的。样品中的A、B两个组分，吸附系数大的组分在薄层色谱的迁移速率慢，而吸附系数小的组分在薄层色谱的迁移速率快，经过一定时间的完全分离，在薄层色谱上形成两个斑点，从而进行分离。

薄层色谱法概述比移值（Rf）

被分离混合物一、比移值和相对比移值比移值与相对比移值说明：1.分配系数K↑大，Rf↓小2.Rf范围：0<Rf<1

Rf=0.2~0.8（常用）0.3~0.5（最佳）

二、相对比移值Rs比移值与相对比移值影响Rf值的因素：展开温度：室温对分离影响不明显。其他条件相同，温度低比温度高时展开慢，分离好。薄层厚度：板厚度变化对比移值影响明显；厚度达0.2mm时，影响较小；在0.25mm时，分离效果最佳。吸附剂含水量：与吸附剂的种类、使用时的加水量、风干时间、活化温度和活化时间等因素有关。比移值与相对比移值层析缸中蒸气：缸中蒸气未达饱和时，比移值不能重现。为使缸中蒸气饱和，可以在缸内壁附上一层滤纸，让展开剂全部湿润；把展开剂放入层析缸一段时间后再放薄层板；尽可能在恒定温度下层析。其他影响因素：展开剂的pH、展开时间、展开距离、样品浓度、点样量、薄层板所用吸附剂中的粘合剂的种类和用量等，都有可能影响样品组分比移值的大小。比移值与相对比移值实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别一、实验原理：

薄层吸附色谱是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上做固定相，经干燥活化后点上样品，以适当极性的有机溶剂作为展开剂。由于组分的性质差异，易被固定相吸附的组分移动慢，难被固定相吸附组分移动快。经过一段时间的展开后，不同组分彼此分开，形成相互分离的斑点。

本实验以硅胶为固定相，以95%乙醇溶剂为展开剂分离二甲基黄、罗丹明B以及两者的混合物。二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别

二、实验仪器及试剂：仪器：玻璃片、毛细管和层析缸；

试剂：二甲基黄溶液、罗丹明B溶液，两者的混合液、硅胶、0.5%羧甲基纤维素钠；

二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别三、实验步骤：铺板点样展开计算Rf值

采用倾注法：称取5g硅胶于研钵中，并加入8mL的CMC-Na，调成糊状，将调好的糊状物倒在玻璃板上，用手摇晃，使糊状均匀地分布于整块薄板上，活化后方可使用；本实验所用样品本身有颜色，故无须显色即可计算Rf值。二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别四、数据处理：

混合样品中，易被固定相吸附的是罗丹明B，难被吸附的是二甲基黄。量出样品原点到各色斑中心点的距离和样品原点到各溶剂前沿的距离，按公式计算Rf值。二甲基黄与罗丹明B的薄层色谱的鉴别实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理氨基酸的纸色谱分析一、实验原理：

纸色谱是以滤纸为载体，固定相是滤纸纤维上吸附的水分，流动相是指与水相混溶的有机溶剂，样品在水与展开剂之间连续分离，依靠溶质在两相间的分配系数不同而达到分离目的。

氨基酸是无色的化合物，可与茚三酮反应显色，溶剂自滤纸挥发后，喷上茚三酮溶液后加热，可形成色斑而确定其位置。氨基酸的纸色谱分析

二、实验仪器及试剂：仪器：色谱纸、毛细管、层析缸、喷雾器和电吹风等；

试剂：0.5%丙氨酸、0.5%亮氨酸以及混合液（1：1）、饱和的正丁醇、醋酸以及0.1%水合茚三酮-正丁醇溶液。

氨基酸的纸色谱分析三、实验步骤：点样展开显色计算Rf值。将展开完毕的滤纸，用电吹风吹干，使展开剂挥发。然后喷上0.1%水合茚三酮-正丁醇溶液，再用电吹风热风吹干，即出现氨基酸的色斑。氨基酸的纸色谱分析四、数据处理：分别计算丙氨酸和亮氨酸的Rf值。

氨基酸的纸色谱分析一、概论分离原理：以滤纸为载体的色谱法；固定相：纸纤维吸附的水（或以氢键结合的水）；流动相：与水不互溶的有机（或与水相混溶的）溶剂；分离机制：同液-液分配色谱，利用样品中各组分在两相互不相溶的溶剂间分配系数不同实现分离的方法；定性参数：比移值Rf、相对比移值Rs；正相分配纸色谱：极性大的组分，移动速度慢，Rf小。

纸色谱法二、操作方法1.点样用内径为0.5mm的平头毛细管或微量注射器点样，将1～2μL样品溶液点在起始线原点上，可反复点几次，点样后用红外灯或电吹风迅速干燥。2.展开展开剂的选择选择展开剂主要根据样品组分在两相中的溶解度，即分配系数来考虑。纸色谱法3.斑点的定位展开完毕后，取出滤纸，在展开剂到达的位置划一条前沿线，观察有无色斑，然后置紫外灯下观察荧光斑点，标出位置、颜色、记录大小和强度。纸层析装置示意图纸色谱法定性定量

由于影响Rf值的因素较多，而使Rf值不易重现，因此常将样品与对照品同时在同一块滤纸上随行展开进行比较；或测量色斑的Rs值后进行定性。4、定性与定量分析纸色谱法柱色谱应用柱色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理的分配方法。色谱体系包含两个相：固定相和流动相。当两相相对运动时，反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异，最后达到彼此分离的目的。主要分为以下几种类型：液-固吸附色谱液-液吸附色谱离子交换色谱离子对色谱分子排斥色谱亲和色谱（一）液-固吸附柱色谱法（liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固体吸附剂，流动相：液体

原理：利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异

K越大，组分越容易被吸附，保留时间越长，迁移速度越慢，

后流出色谱柱。

吸附平衡

吸附系数（平衡常数）柱色谱应用1.吸附剂吸附剂为多孔性微粒物质。常用的有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。需满足以下条件：具有较大的吸附表面和吸附中心；与样品、溶剂和洗脱剂均不发生化学反应；不能被溶剂或洗脱剂溶解；粒度均匀，且有一定的粒度。柱色谱应用（1）硅胶适用于酸性或中性物质（2）氧化铝

碱性氧化铝pH9.0～10.0适于分析碱性、中性物质中性氧化铝pH＞7.5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4.0～5.0适于分析酸性、中性物质（3）聚酰胺

氢键作用，氢键能力↑强，组分越后出柱。注：吸附剂含水量越大，活性级别越高，吸附活性越低，吸附能力越弱。常用的活化方法是加热除水。（4）大孔吸附树脂

柱色谱应用2.流动相流动相具有洗脱作用。其洗脱能力决定于流动相占据吸附剂表面活性中心的能力。极性强的流动相分子，具有强的洗脱作用。极性弱的流动相洗脱作用弱。为了使样品中吸附能力稍有差异的各组分分离，需同时考虑到被分离物质的性质、吸附剂的活性和流动相的极性三方面的因素。柱色谱应用被分离物质的结构与性质极性越大，越容易被吸附，吸附能力越大。吸附剂的选择吸附剂的活性越大，对被测组分的吸附能力越强流动相的选择“相似相溶”原则

三者关系：组分吸附剂流动相极性大活性小极性大极性小活性大极性小柱色谱应用3.操作方法（1）装柱（干法和湿法）柱装的要均匀，不能有缝隙或气泡，以免影响分离效果。（2）加样（3）洗脱洗脱剂可以是一种溶剂或混合溶剂。在洗脱过程中应不断加入洗脱剂，保持色谱柱顶有一定高度的液面，控制好洗脱剂的流速。柱色谱应用（二）液-液分配色谱（liquid-liquidadsorptionchromatography）1.全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；2.表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；柱色谱应用3.化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。特点:稳定，耐水、耐光和耐有机溶，是目前应用最广、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

Cc.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N

柱色谱应用化学键合固定相的特点：（1）传质快:表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长:化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好:可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；柱色谱应用（三）离子交换色谱（ion-exchangechromatography）原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；

固定相：阴离子或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+

阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-

应用：离子、可离解的化合物、氨基酸和核酸等。柱色谱应用固定相结构类别：薄壳型离子交换树脂担体：薄壳玻璃珠，表面涂约1%的离子交换树脂；离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）柱色谱应用（四）离子对色谱（ionpairchromatography）

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18柱)，含有阳离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。柱色谱应用（五）分子排斥色谱（size-exclusionchromatography）

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。柱色谱应用ABCD柱色谱应用（六）亲和色谱（Affinitychromatograph）原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。柱色谱应用

（1）外标法(标准曲线法)：将欲测组分的纯物质配制成不同浓度的标准溶液进行色谱分析，以峰面积对浓度作图。测得样品的信号后从标准曲线上查出对应浓度。123456SampleAmmiAi气相色谱定量分析方法（2）内标法准确称取样品（m），加入一定量（ms）某种纯物质作为内标物，进行色谱分析，根据被测物与内标物的相应峰面积（或峰高）和相对校正因子，求出被测组分的含量。样品内标物siAsAisiimfAm=AsssAisisifAfAmm=%100%

=AisssiifmAAmm气相色谱定量分析方法内标物要满足以下要求：①试样中不含有该物质；②与被测组分性质比较接近；③不与试样发生化学反应；④出峰位置应位于被测组分附近。（3）归一化法：(前提：样品中所有组分都有响应（出峰）)

将试样中所有组分的含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下式计算各组分的量：%100%1

=

=niAisiAisiifAfAmi气相色谱定量分析方法气相色谱定性分析1.根据色谱保留值进行定性分析

（1）利用保留时间定性在相同的色谱条件下，将对照品与样品分别进样，两者保留时间相同，可能为同一物质。对照品待测品（2）利用相对保留值定性

相对保留值是任一组分（i）与标准物(s)的调整保留值之比即

与组分性质、柱温和固定相性质有关。将测得的相对保留值与手册或文献报道的相对保留值对比，完成定性判断。（3）利用峰高增量

若样品复杂，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含有该物质。气相色谱定性分析SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD2.利用联用仪器定性小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS)以及色谱-红外光谱仪联用仪：组分的结构鉴定DC气相色谱定性分析实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理维生素E的含量测定一、实验原理：

维生素E原料及其制剂各国药典多采用气相色谱法，可分离维生素E及其同分异构体，选择性地测定维生素E。

内标法为定量分析依据。维生素E的含量测定

二、实验仪器及试剂：仪器：气相色谱仪、HP-5石英毛细管色谱柱（30.0m×320μm）、火焰离子化检测器（FID）和氢气钢瓶等；

试剂：正三十二烷、正己烷、维生素E对照品和维生素E软胶囊。维生素E的含量测定三、实验步骤：1.测定的色谱条件与系统适应性试验：

色谱柱：HP-5石英毛细管色谱柱；柱温：265℃；理论塔板数按维生素E峰计算应不低于5000；2.校正因子测定：

配制1g/mL浓度的内标（正三十二烷）溶液；另取维生素E

对照品约20mg，精密加内标溶液10mL，振摇使溶解；取1-3μL注入气相色谱仪，计算校正因子；维生素E的含量测定4、标准溶液的配制：

精密称取维生素E对照品20mg，量取正三十二烷内标物10mL，定容至100mL，得标准溶液；5、供试液的制备：

精密称取维生素E胶丸20mg，加内标物10mL，定容至100mL，得供试品溶液；6、测定：待基线平直后，分取供试液和标准溶液各1-3μL注入气相色谱仪，记录峰面积，再计算含量。维生素E的含量测定四、数据处理：校正因子：含量计算=标示量百分含量=维生素E的含量测定气相色谱概述气相色谱仪示意图

1.载气系统2.进样系统3.分离系统4.检测系统5.记录系统

气相色谱概述

工作流程：

载气从高压钢瓶输出后，经减压、稳压、稳流和净化处理，流经气化室，将气态试样带入色谱柱，分离后的组分随载气依次流出色谱柱，进入检测器，检测器将载气中各组分浓度或质量的变化转换为强弱不同的电信号，放大后得到色谱流出曲线，经色谱工作站进行数据处理和分析。气相色谱概述一、色谱柱按柱的直径分为两类：

填充柱：多数是内径4～6mm的不锈钢管柱，填充吸附剂（气-固色谱）或液态固定相（气-液色谱），常用柱长为2～4m；

毛细管色谱柱：常用的是内径为0.1～0.5mm的玻璃或石英毛细管，柱长几十米至百米。气相色谱概述1.气-固色谱填充柱

硅胶、氧化铝、石墨化碳黑、分子筛、高分子多孔微球及化学键合相等都可作为气-固色谱填充柱的固定相。它们的共同特点是具有一定的吸附活性。2.气-液色谱填充柱（1）固定液的选择应遵循“相似相溶”原则；（2）载体：载体分为硅藻土型和非硅藻土型。

气相色谱概述3.毛细管色谱柱

毛细管柱分为开管型和填充型，开管型毛细管柱主要有两种：一种是涂壁毛细管柱（WCOT），是将固定液直接涂在毛细管内壁制成；另一种是载体涂层毛细管柱（SCOT）。气相色谱概述2.检测器的性能指标（1）噪声和漂移

噪声：无样品通过时，仪器本身和工作条件等偶然因素引起基线的起伏（以噪声带衡量）。

漂移：基线随时间向一个方向的缓慢变化（以一小时内的基线水平变化来表示）。气相色谱概述（2）灵敏度（S）：S表示单位质量的物质通过检测器时，产生的响应信号的大小。S值越大，检测器（也即色谱仪）的灵敏度也就越高。检测信号通常显示为色谱峰，则响应值也可以由色谱峰面积（A）除以试样质量（m）求得：

S=A/m气相色谱概述（3）检测限

噪声水平决定着能被检测到的浓度（或质量）。如果要把信号从本底噪声中识别出来，则组分的响应值就一定要高于N。检测器响应值为2倍噪声水平时的试样浓度（或质量），被定义为最低检测限（或该物质的最小检测量）。气相色谱概述三、常用的检测器1．热导检测器(TCD)

利用被测组分与载气的热导率不同，检测组分的浓度变化。

特点：结构简单、稳定性好、线性范围宽、测定范围广，且样品不被破坏，易与其他仪器联用；但灵敏度较低，噪音较大。

2.电子捕获检测器（ECD）

利用电负性物质捕获电子的能力，通过测定电子流进行检测的浓度型检测器。特点：具有选择性高、灵敏度高的特点。气相色谱概述3.氢焰离子化检测(FID)

利用样品组分在氢焰的作用下，燃烧变成离子，在电场作用下形成离子流（电流），通过测定离子流强度进行检测的检测器。特点：灵敏度高，噪音小，死体积小，线性范围宽，但一般只能测定有机物，检测时样品遭到破坏。气相色谱概述4.火焰光度检测器（FPD）

是对含硫、含磷化合物具有高选择性和高灵敏度的检测器，又称硫磷检测器。火焰光度检测器与氢焰检测器联用，可以同时测定硫、磷和含碳有机物。气相色谱概述四、分离条件的选择1.色谱柱的选择

根据不同的分析试样和分析要求可选择填充柱和毛细管柱。在保证分离的条件下，应采用尽可能短的色谱柱。2.载气种类和流速的选择（1）载气种类的选择载气种类的选择应考虑三个方面：载气对柱效的影响、检测器要求及载气性质。气相色谱概述（2）载气流速的选择由图可见存在最佳流速（uopt）。实际流速通常稍大于最佳流速，以缩短分析时间。气相色谱概述（3）柱温的选择选择柱温的基本原则：

在使最难分离的组分有较好分离度的前提下，尽量采取低柱温，并应以保留时间适宜且色谱峰不拖尾为度。色谱柱的温度控制方式有恒温和程序升温二种。气相色谱概述程序升温:对于沸点范围很宽的混合物，往往采用程序升温法进行分析。程序升温指在一个分析周期内柱温随时间由低温向高温作线性或非线性变化，以达到用最短时间获得最佳分离的目的。气相色谱概述恒温和程序升温分析烃类化合物气相色谱概述

五、进样条件的选择1.进样速度

进样速度要快，一般在很短时间（1秒）内完成进样，否则，样品原始宽度增大，使色谱峰扩张甚至变形。2.进样量进样量应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。对于填充柱，液体进样量一般小于5μL，气体进样量为0.1～1mL。3.气化温度气化温度取决于样品的挥发性、稳定性、沸点及进样量。适当提高气化温度对样品的分离及定量有利。一般可高于柱温30～50℃。气相色谱概述色谱图

试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入检测器，检测器的响应信号—时间曲线称为色谱流出曲线，又称色谱图。色谱流出曲线

1.色谱流出曲线基线:在操作条件下，色谱柱后没有组分流出，仅有流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，基线的波动程度反映仪器检测系统噪声的大小。色谱峰:当样品中的组分随流动相进入检测器时，检测器的响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰。

峰面积和峰高

峰面积：是指峰与峰底之间的面积，用A表示。

峰高：是指色谱峰最高点到峰底的垂直距离，用h表示。色谱图

区域宽度用于衡量色谱柱效能，包括峰宽、半峰宽和标准偏差。（1）峰宽是色谱峰两侧拐点处的切线在基线上截取的距离，用W表示。（2）半峰宽是色谱峰高一半处的峰宽用W1/2表示。（3）标准偏差是0.607倍峰高处峰宽的一半，用σ表示。色谱图

W、W1/2和σ表示正态分布色谱峰不同峰高处的区域宽度，是衡量色谱柱效能的三种指标，其中W1/2值最容易测量，常用W1/2评价柱效。W、W1/2和σ之间存在以下数学关系：色谱图2保留值保留时间是组分从进样到出现信号最大值时的时间，用tR表示。保留体积是组分从进样到出现信号最大值所需要流过流动相的体积，

用VR表示。

式中，Fc是流动相的体积流速(ml/min)。死时间是不被固定相滞留组分的保留时间，用tM或t0表示，tM反映流动相通过色谱柱所需要的时间。色谱图3.分配系数和分配比

分配系数色谱过程中，处于动态平衡时组分在固定相与流动相中的浓度之比为分配系数。K随温度变化而变化，与固定相、流动相的体积无关。色谱图

分配系数比是指混合物中相邻两组分的分配系数或容量因子或调整保留值之比。

分配系数比与柱效参数及定性参数密切相关,容量因子或分配系数不等是混合试样分离的前提条件。色谱图4.分离度

综合考虑的峰间距离和峰宽两方面的因素，常用分离度作为色谱柱的总分离效能指标。当R=1.5时，两峰完全分开，分离程度达到99.7％。定量分析常以R=1.5作为相邻两组分色谱峰完全分离的标志。色谱图速率方程（范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度；u：载气的线速度(cm/s)注：减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？速率理论A-涡流扩散项

固定相颗粒越小，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，涡流扩散项为零。

速率理论B/u-分子扩散项①存在着浓度差，产生纵向扩散②扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差③分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑④选择分子量大的载气(如N2)，以减小纵向扩散，增加柱效速率理论

降低固定相液膜厚度，并增加组分在固定相中的扩散系数，可以减少传质阻力，提高柱效。

C·u-传质阻力项速率理论将色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。塔板理论的假设：（1）在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；（2）将载气看作成脉冲（间歇）过程；（3）试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；（4）每次分配的分配系数相同。塔板理论色谱柱长：L;虚拟的塔板间距离：H;色谱柱的理论塔板数：n;则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配。塔板理论

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：塔板理论实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理阿莫西林的含量测定

一、实验仪器及试剂：仪器：高效液相色谱仪、二极管阵列检测器和C18色谱柱等；

试剂：阿莫西林对照品、阿莫西林胶囊、磷酸二氢钾、氢氧化钾、乙腈（色谱级）和重蒸馏水等；

阿莫西林的含量测定二、实验原理：

阿莫西林为β-内酰胺类抗生素，《中国药典》（2015版）规定，其标示量的百分含量不得少于95%。它的分子结构中有羟苯基取代，有紫外吸收的特征，可用紫外检测器检测。

外标法作为定量分析的依据。阿莫西林的分子结构阿莫西林的含量测定三、实验步骤：1.试剂的配制：

分别配制2mol/L的氢氧化钾溶液和0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液；2.组分溶液的配制：分别配制对照品溶液和试样溶液。试样溶液经0.45

μm的微孔滤膜滤过后方可进样分析；

阿莫西林的含量测定3、测定（1）色谱条件与系统适应性试验：色谱条件：C18（4.6mm×250mm,5μm）;流速为：1mL/min;流动相：0.05mol/L磷酸缓冲盐（PH=5）-乙腈（97.5：2.5）检测波长：254nm;柱温：30℃；（2）取上述对照品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图（保留时间、峰高或者峰面积）。平行测定三份；（3）取上述试样溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图（保留时间、峰高或者峰面积）。（2）和（3）保留时间应一致。平行测定三份。阿莫西林的含量测定四、数据处理：阿莫西林的含量测定

（1）外标法(标准曲线法)：将欲测组分的纯物质配制成不同浓度的标准溶液进行色谱分析，以峰面积对浓度作图。测得样品的信号后从标准曲线上查出对应浓度。123456SampleAmmiAi高效液相色谱定量分析方法（2）内标法准确称取样品（m），加入一定量（ms）某种纯物质作为内标物，进行色谱分析，根据被测物与内标物的相应峰面积（或峰高）和相对校正因子，求出被测组分的含量。样品内标物siAsAisiimfAm=AsssAisisifAfAmm=%100%

=AisssiifmAAmm高效液相色谱定量分析方法内标物要满足以下要求：①试样中不含有该物质；②与被测组分性质比较接近；③不与试样发生化学反应；④出峰位置应位于被测组分附近。高效液相色谱定量分析方法（3）归一化法：(前提：样品中所有组分都有响应（出峰）)

将试样中所有组分的含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下式计算各组分的量：%100%1

=

=niAisiAisiifAfAmi高效液相色谱定量分析方法高效液相色谱定性分析1.根据色谱保留值进行定性分析

（1）利用保留时间定性在相同的色谱条件下，将标准品与样品分别进样，两者保留时间相同，可能为同一物质。对照品待测品（2）利用相对保留值定性

相对保留值是任一组分（i）与标准物(s)的调整保留值之比即

与组分性质、柱温和固定相性质有关。将测得的相对保留值与手册或文献报道的相对保留值对比，完成定性判断。（3）利用峰高增量

若样品复杂，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含有该物质。高效液相色谱定性分析SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD2.利用联用仪器定性小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS)色谱-红外光谱仪联用仪：组分的结构鉴定DC高效液相色谱定性分析实验原理实验仪器与试剂实验步骤实验数据的处理维生素K1注射液的含量测定一、实验原理：

维生素K1注射液临床上常用于治疗维生素K缺乏引起的出血。低凝血酶原血症以及长期应用广谱抗生素所致的体内维生素K缺乏。《中国药典》（2015版）规定，其含维生素K1应为标示量的90.0%-110.0%。它的分子结构中共轭芳环结构具有紫外吸收的特征，可用紫外检测器检测。

外标法作为定量分析的依据。维生素K1注射液的含量测定

二、实验仪器及试剂：仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器和C18色谱柱等；

试剂：维生素K1对照品、维生素K1注射剂、无水乙醇、乙腈（色谱级）和重蒸馏水等；

维生素K1注射液的含量测定三、实验步骤：1、组分溶液的配制：分别配制一定浓度的对照品溶液和试样溶液。试样溶液经0.45

μm的微孔滤膜滤过后方可进样分析；2、测定（1）色谱条件与系统适应性试验：色谱条件：C18（4.6mm×250mm,5μm）;流速为：1mL/min;流动相：

乙醇-水（90：10）检测波长：254nm;柱温：25℃；

维生素K1注射液的含量测定（2）取上述对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图（保留时间、峰高或者峰面积）。平行测定三份；（3）取上述试样溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图（保留时间、峰高或者峰面积）。（2）和（3）保留时间应一致。平行测定三份。维生素K1注射液的含量测定四、数据处理：维生素K1注射液的含量测定一、定义：高效液相色谱法(HPLC)：在经典液相色谱和气相色谱的理论和实验技术基础上建立的一种液相色谱法。高效液相色谱概论二、与经典的液相色谱法比较，具有以下优点：1、高效：使用极细颗粒、规则均匀的固定相和均匀填充技术，使传质阻力降低，柱效高，分离效率高；2、高速：采用高压输液泵输送流动相，流速快，分离速度快；3、高灵敏度：使用紫外、荧光、电化学等高灵敏度检测器；4、高自动化：智能化的色谱工作站结合自动进样装置；实现操作的全自能化。高效液相色谱概论129三、与气相色谱法比较，具有以下优点：1、分析范围广：不受试样挥发性和热稳定性的限制；2、分离选择性高：流动相的性质对分离的选择性有很大的作用；3、试样制备简单：试样组分制备简单、组分经色谱分离后不被破坏，易于收集；高效液相色谱概论四、基本理论（一）柱内展宽动力学理论：速率理论——Vander方程

l．涡流扩散项(A)：与GC相同2．纵向扩散项（B/u）：可忽略不计

原因：流动相黏度大，扩散系数3．传质阻力项(Cu)：包括固定相传质阻力、流动相传质阻力、滞留流动相传质阻力。

高效液相色谱概论

结论：在高效液相色谱法中，由于纵向扩散项可以忽略不计，故高效液相色谱的速率方程可简写为：因为高效液相色谱法中的涡流扩散项较小，所以，其影响柱效的主要因素是传质项。（二）柱外展宽

柱外展宽：因色谱柱外各种因素引起的色谱峰展宽。主要包括进样系统、连接管路、接头、检测器等色谱柱之外的各种因素。

减少柱外因素对峰宽的影响可采用进样阀进样，使用“零死体积接头”连接管路和内腔体积小的检测器。高效液相色谱概论高效液相色谱仪高效液相色谱仪的组成：

主要包括输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统和数据处理系统。

（一）输液系统

输液系统主要包括贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置。高压泵是输液系统的核心，借助高压泵使稳定流量的流动相快速通过固定相。高效液相色谱仪（二）进样系统

高效液相色谱仪普遍采用六通进样阀高压进样。六通进样阀具有进样量准确、重复性好等特点。但进样阀有死体积，易引起色谱峰扩展。

装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱高效液相色谱仪（三）分离系统

色谱柱是最关键的部件，由柱管和固定相组成，用于样品分离。柱管通常为内壁抛光的不锈钢管，形状几乎都是直形，能承受高压，对流动相呈化学惰性。高效液相色谱仪（四）检测系统1．紫外-可见光检测器

其检测原理和UV-Vis方法一样。只是采用的吸收池为微量吸收池，其光程为2～10mm,体积约为1～10

L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。此类检测器应用很广。高效液相色谱仪

特点：1.灵敏度高；2.线形范围高；3.流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；4.对流动相的流速和温度变化不敏感；5.波长可选择，易于操作；可用于梯度洗脱。

石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液高效液相色谱仪

2．荧光检测器

测定原理：依据某些物质吸收一定波长的紫外光后能发射出一种比吸收波长更长的光波（荧光），荧光强度与荧光物质浓度的关系服从比尔定律。

特点：灵敏度高、选择性好等。并非所有物质都能产生荧光，应用范围较窄。高效液相色谱仪3．示差折光检测器

一种通用检测器，依据不同性质的溶液对光具有不同折射率对组分进行检测，测得的折光率差值与样品组分浓度成正比。只要物质的折射率不同，就可进行检测，但检测灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板高效液相色谱仪

4.电化学检测器

电化学检测器是一种选择性检测器，依据组分在氧化还原过程中产生的电流或电压变化对样品进行检测。

特点：适于测定氧化活性和还原活性物质，测定的灵敏度较高，检测限可达10-9g/ml。高效液相色谱仪5.光电二极管阵列检测器

光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。高效液相色谱仪高效液相色谱仪6、蒸发光检测器原理：首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。高效液相色谱仪优点：（1）可检测挥发性低于流动相的任何样品；（2）流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度；（3）广泛的梯度和溶剂兼容性，无溶剂峰干扰；（4）辅助载气提高了检测灵敏度，保持检测池内的清洁，避免污染；（5）高精度雾化和蒸发温度控制，保证高精度检测；（6）可与任何HPLC系统连接。高效液相色谱仪固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相和组分发生化学反应；分为：经典的液-固色谱固定相、液-液色谱固定相、离子交换色谱固定相和分子排阻色谱固定相。目前应用最多的是化学键合固定相，可分离几乎所有类型的化合物。高效液相色谱固定相（一）液-固吸附色谱固定相常用的固定相有硅胶、氧化铝、高分子多孔微球、分子筛及聚酰胺等。其中硅胶的应用最为广泛。

1.硅胶：常制备成表孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶及堆积硅珠等类