当归对宫内缺氧后新生大鼠肾脏内血管内皮生长因子表达的影响

1/1当归对宫内缺氧后新生大鼠肾脏内血管内皮生长因子表达的影响当归对宫内缺氧后新生大鼠肾脏内血管内皮生长因子表达的影响【摘要】目的研究当归对宫内缺氧后新生大鼠肾脏内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。

方法将孕期14d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组。

缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天一次经尾静脉注射生理盐水8ml/kg（连续7d），后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2h（连续3d：

孕期第14，15，16天）；当归治疗组用250g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组。

3组孕鼠分娩当日取肾组织、多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、VEGF免疫组化、400倍拍照、IPP6.0软件图像分析。

结果缺氧组新生鼠VEGF阳性细胞的数量和积分光密度值均较对照组增大(P＜0.05)，当归组VEGF阳性细胞数量和积分光密度值均较缺氧组减小(P＜0.05)。

结论一定时间、一定氧浓度的宫内缺氧可刺激新生大鼠肾脏VEGF的表达增加；而当归注射液可使VEGF的表达下降。

【关键词】当归；缺氧；肾；血管内皮细胞生长因子血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是调节血管发生的基本生长因子,在肾脏中含量丰富，已有较多证据表明VEGF在肾脏胚胎发育中起重要作用。

宫内缺氧是影响胚胎发育的常见因素，而肾脏是对缺血缺氧最敏感的器官之一，VEGF是调节血管发生的基本生长因子，它可以与内皮细胞上的受体相结合，从而促进内皮细胞的增殖，加速新生血管的生成。

许多组织器官在低氧环境下，都可诱导血管内皮细胞生长因子VEGF的表达，使毛细血管代偿增生，缓解缺氧状态。

近年来也有报道VEGF与肾脏的生理和一些病理状态相关。

本实验试图通过建立宫内缺氧模型，观察在体状态下缺氧对新生大鼠肾脏VEGF表达的影响，探讨VEGF与肾脏缺氧的关系，并观察中药当归对肾脏缺氧状态的调节作用。

1材料鼠抗VEGF（中杉金桥生物技术有限公司）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色)购自武汉博士德生物工程公司；250g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二医院药剂科（批号060926）。

OLYMPUSBx-70荧光显微镜成像系统为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产；德国莱卡切片机；三气培养箱（购自美国REVCO公司）。

SD大鼠15只（220～250g）由泸州医学院动物实验中心提供。

2方法2.1动物配种与分组成年健康SD雌大鼠15只(体质量220～260g)，分别与SD雄鼠合笼配种，次日晨见阴栓记为大鼠怀孕0d，孕鼠随机分为对照组、缺氧组、当归组各5只。

2.2宫内缺氧模型建立参照余鸿［1］等制作的宫内缺氧模型。

当归组孕鼠自孕14d开始，每天下午2：

00经尾静脉注射250g/L的当归注射液8ml/kg（孕第14～20天，连续7d），1h后放入设置好的三气培养箱(氧体积分数130ml／L，温度25℃，二氧化碳体积分数0.4～0.6ml／L)内缺氧2h，连续缺氧3d(孕第14～16天)，第17，18，19，20天仍给予当归注射，但不缺氧。

缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组。

对照组不缺氧，余同缺氧组。

2.3取材、石蜡切片及VEGF免疫组织化学测定每组随机选取15个新生鼠肾脏，然后进行常规石蜡包埋，经肾脏冠状切面切片（片厚4m），每组切片脱蜡至水，各组随机取12张切片分别作VEGF(1∶200）免疫组化染色(常规链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物法)。

其余切片做HE染色，免疫组化切片在400倍显微镜下观察肾脏皮质，每张切片随机选取5个视野,每个视野随机选取3～5个近曲小管。

采用OLYMPUSBx-70荧光显微镜成像系统拍照，经Image-ProPlus5.1图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。

2.4统计学处理各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验。

采用SPSS13.0软件包完成数据分析（Plt;0.05）。

3结果3.1对照组VEGF免疫组化反应阳性细胞分布呈区域性，大多位于肾远曲小管上皮细胞，胞质中有棕黄色颗粒（图1a及表1）。

3.2缺氧组VEGF免疫组化反应阳性细胞分布区域与对照组相似，与对照组相比缺氧组阳性细胞染色增强、阳性细胞数量增加、积分光密度值增大（P＜0.05）（见图1b及表1）。

3.3当归治疗组VEGF免疫组化反应阳性细胞分布与对照组相似，与缺氧组相比缺氧组阳性细胞染色减弱、数量减少、其积分光密度值减小（P＜0.05）（见图1c，表1）。

表13组新生鼠肾脏皮质区VEGF免疫组化结果（略）4讨论新生儿窒息是新生儿死亡和伤残的主要病因之一，本病致死致残的主要原因是缺氧导致新生儿心、脑、肾等多种脏器损伤所致，由于肾血流量大，能量消耗大，因此肾对缺血缺氧比较敏感。

许多组织器官在低氧环境下，都可以诱导血管内皮生长因子VEGF的表达，使毛细血管代偿增生，缓解缺氧状态［2］，目前有关在体状态下缺氧对肾脏组织内VEGF表达的影响研究较少，因此，对缺氧后肾组织VEGF表达变化的研究将有助于阐明缺氧引起肾损伤的发生机制。

肾脏有一套具特殊形态和功能的血管系统，在人肾发育过程中,肾小球、肾小管结构形成的同时,肾的血管也开始发生。

起诱导分化作用的间质产生血管发生因子,分化的肾小球上皮细胞产生VEGF,此时,肾小球内皮细胞表达丰富的VEGF受体（Flt21和KDRmRNA）,内皮细胞被吸引入肾小球并向内生长。

与此类似,集合管上皮细胞产生VEGF,皮髓质肾小管周毛细血管内皮细胞存在VEGF受体,促使肾小管周毛细血管发生。

在新生鼠肾脏发育时,抗体阻断内源VEGF,动物的肾皮质表层的血管形成受阻,发育的肾单位数目明显减少,有许多缺乏毛细血管丛的异常肾小球，说明VEGF在肾脏发育尤其肾小球形成中起重要作用。

本研究在HE染色切片上，观察到缺氧组肾近曲小管上皮细胞体积变大，胞浆可见颗粒状物，管腔变窄，部分核碎裂、溶解，出现了明显水肿，说明3d(2h/d)缺氧后，导致了肾脏结构的形态学改变。

另外在肾脏免疫组化染色切片上观察到缺氧3d(2h/d)组胚鼠肾脏VEGF免疫组织化学反应增强、阳性细胞增多，说明缺氧后VEGF表达量增加，但随着氧浓度和缺氧时间的变化，VEGF在肾脏的表达尚需进一步的研究。

缺氧状况下，有关肾组织中VEGF表达是否增加目前结论不一，有学者认为缺氧能显著增加肾组织VEGF表达,但也有学者认为,缺氧并不能引起肾组织表达增加,只是的分布发生了变化，而Simon［3］等发现胚胎及成年在肾小球及周围有大量VEGF的受体表达，导致以上结论不一可能与研究者采用的缺氧浓度大小或缺氧时间长短有关。

当归是国药精华，其味甘而重，专能补血；其气轻而辛，又能行血。

现代研究表明，当归含有挥发性和水溶性两大类成分。

对人体不仅有抗贫血、血小板聚集和血栓形成、改善血流、清除氧自由基、抗衰老、解痉、抗炎［4］、抗过敏、增强人体免疫功能的作用，并且升高子宫组织中一氧化氮水平、降低钙离子水平，具有明显缓解痛经的作用［5］。

此外，在肾保护方面，现代药理学研究表明中药黄芪与当归能够通过多种途径改善微血管病变，包括增加局部组织的血流灌注以减轻组织的缺氧性损伤、促进缺血再灌注后肾血流量和肾小球滤过率的恢复、纠正一氧化氮／血管紧张素等血管活性物质的失衡、抑制细胞内钙的释放和促进血管表皮生长因子表达及血管内皮细胞DNA合成以改善内皮细胞功能。

提示黄芪、当归可能通过上述机制起到延缓肾脏疾病进展作用［6］。

本实验中，当归组的VEGF的表达较缺氧组减少，说明当归注射液减弱了缺氧刺激引起的VEGF的表达量的增加，即推测当归对缺氧刺激有缓解、保护作用，可明显减轻肾脏的损伤。

通过对以上当归的药理学方面综合分析，当归一方面可以通过扩张血管、改善循环，增加子宫及脐带供血；另一方面，可以缓解平滑肌痉挛，减低子宫的反应性；另外，还可以通过清除自由基、抗脂质氧化能力等途径起作用。

从本实验的结果中推测当归的具体保护机制可能与VEGF的大量激活有关，且当归的缓解、保护理论也为以后的宫内缺氧临床预防与治疗提供依据。

【参考文献】1］HongYu,HeshengYue,XudongChen,etal.EffectofAngelicasinensisonneuralstemcellproliferationinneonatalratsfollowingintrauterinehypoxia［J］.NeuralRegenerationResearch，2008，3(7):733.［2］AtsushiN,EdiB,MarianneK,etal.Hypoxiainducesvascularendothelialgrowthfactorinculturedhumanendothelialcells［J］.JBiolChem,1995,270(52):31189.［3］SimonM，RocklW，HorniqC.etal.Receptorsofvascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactor(VEGF/VPF)infetalandadulthumankidney:localizationand［125I］.VEGFbindingsites［J］..JAmSocNephrol,1998，9(6):1032.［4］邓敏,谢平，