《现代生物学检测与分析技术》(研究生)全册配套完整课件

《现代生物学检测与分析技术》(研究生)全册配套完整课件二十一世纪是

生命科学的世纪人类面临的挑战人口2050年全球73亿－103亿食品供应每年全球6岁以下儿童因营养死亡600万人健康问题耐药菌、老龄化，现代生活病环境物种保护环境破坏生物多样性降低新疾病新生病毒、微生物

我国科研人员培育的“超级水稻”在产量和蛋白质含量两方面均优于寻常品种

粮食

生命科学向我们每个人走来小麦专家杂交稻专家国家最高科技奖获得者到2025年，世界人口有望突破80亿，多数增长将发生在发展中国家，而且要在复杂的环境下喂养更多张嘴绿色革命之父诺贝尔和平奖获得者博劳格估计:所有谷物的平均产量必须比1990年的平均产量高出80％迎接全球农业挑战农业生物技术掀起第2浪潮,全球农业生物技术产值将达到100亿美元。我国正在研究的转基因植物种类达47种.

健康

80年代，在美国发现第一例艾滋病，至今美国已有>106感染者。洛杉矶湖人队一著名球星，1991年被检查出为HIV病毒阳性。我国严峻的健康问题

重大疾病问题是世界各国发展道路上不可回避的障碍。我国面临传染性疾病和慢性非传染性疾病的双重负担，心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病等疾病发病人数多，逐年上升，慢性疾病占疾病死亡的70％以上。我国高血压、高血脂异常患者各1.6亿人，其中心脑血管疾病患者约有4000多万，此外还有糖尿病患者9300多万。我国目前每年肿瘤死亡人数近200万人，肿瘤防治面临着巨大的压力。

开创了肿瘤诱导分化治疗白血病的新模式，根据这个原理，将全反式维甲酸用于M3白血病治疗取得成功。

资源

矿物能源（石油、煤）必将枯竭，油价飞涨已经出现，生物能源已在开发之中。很多不起眼的生物，很可能就是药物、材料等的宝贵资源。图为墨西哥荒原中的仙人掌类植物。

一个20米直径的水池年产4吨藻类，加工后可得相当于3000升柴油的燃料。

一英亩三角大戟可生产相当于50吨石油的燃料。图为生长在淡水和海水中的一种硅藻生物柴油又称燃料甲酯，其性能与0#柴油相近，可以直接在柴油发动机上使用。使用生物柴油的发动机排放出的尾气，有害物含量比普通柴油低50%，因此生物柴油是一种清洁的可再生能源，其原料来源相当广泛，大豆油、玉米油、菜籽油、棕榈油，甚至还可以是动物脂肪或者废食用油等，麻疯树则由于其果实的出油率高达30%以上，因此在国际上有“生物柴油树”之称。

环境这是最早一份关于环境对生物种群影响的研究

工业化前英国乡村有很多白色蛾子停在布满淡色苔藓的树皮上，不易被鸟发现；工业化后，黑色蛾子逐渐取而代之，因为黑烟污染了环境，黑色蛾子更易藏身。环境与健康微生物发酵处理环境污染物是重要的方向，化废为宝！生活垃圾、粪便！浪漫思考生命的本质是什么？遗传信息的传递、表现和适应、进化，是生命非常本质的东西。遗传物质是不是DNA，能否是RNA或者有没有新的形式？病毒算不算生命？转座子算不算生命，有无生物的重要特征？计算机病毒算不算生命？砷替代磷生命的新形式地球上发现了砷基生命，这可能是本年度最大的科学发现。2010年12月3日NASA（美国国家航空航天局）公布了一个“震撼世界”的消息：我们在地球上，确切地说是在美国加州的莫诺湖（MonoLake），发现了对太空生物学很重要的东西：一种非凡的细菌“砷基生命”。RNA是比DNA更早的遗传物质形式，那么砷酸DNA是如何进化的（或者说，利用砷的能力是如何进化的），也是需要我们思考的问题。是该种微生物及其祖先在进化过程中其DNA中的磷逐渐被砷取代？还是在生命进化的早期，也存在着砷酸RNA呢？”一生物工程与生物技术

1生物工程的5大板块说经典基因工程细胞工程蛋白质工程酶工程发酵工程基因工程:生物技术的核心2生物工程概念拓展：

综合生物工程的5大技术，强调了现代生物技术为核心的应用，突破了原有的框框；例如PCR基因扩增技术；基因芯片衍生的基因检测技术和应用；基因测序技术；纳米生物技术3生物工程硕士＝生物领域里的工程硕士，培养具有理论联系实际，实践经验，动手能力，解决实际问题的应用型人才概念更加广泛，方向更多。生态环境保护，生物信息学…..生物工程已经被国家列为一级学科！4生命科学与技术关系：科学问题与解决方法，理论与应用的关系科学是基础和核心，技术应用是动力和手段相辅相成，相互促进。回顾生命科学发展历史，每次生物技术的突破均极大推动了生命科学的发展染色体核型分析,染色体显微切割技术，蛋白电泳,印迹转移技术，

PCR，测序技术，芯片技术，转基因与基因治疗,基因剔除小鼠,转基因动物生物克隆(核移植)，诱导干细胞。现代生物学检测与分析技术

是重要的核心课程1现代生物学检测与技术包含（板块）遗传学分析与检测技术

DNA(基因组DNA序列分析，多态性，突变，甲基化)，

RNA（mRNA，选择性剪切，miRNA）遗传毒理分析技术

基因转移与干扰技术

细胞基因转染;基因功能研究基因治疗;

转基因小鼠蛋白质学分析与检测技术

Westernblot，ELISA,2D凝胶电泳，氨基酸序列分析，肽段指纹谱

细胞学分析与检测技术

细胞显微结构，亚显微结构，细胞形态学，细胞生长，凋亡，迁移，三维生长细胞工程:细胞分选,显微注射,核移植

生物化学分析与检测技术

最为广泛，包括了核酸，蛋白质，脂，糖，有机化学分子等,强调非核酸和蛋白质有机大分子检测。

微生物分析与检测技术2现代生命科学发展需要检测和分析技术生命在各个层次反映出复杂和多元化的信息，需要全面和综合的检测和分析生命科学交叉纵横的，相互依托，单一检测和分析，盲人摸象，片面；生命科学的深入研究需要各项技术支撑，生物检测和分析技术促进了生命科学发展。生物学检测和分析技术是生命科学应用的基础医学，农业，工业，环境等领域的生物检测和分析技术是生物技术的重要内容

大型仪器设备与生物检测和分析技术技术原理不等于技术应用；需要发展相关仪器设备例如:生物芯片的发展史；基因测序的发展史生物检测和分析技术依托于大型仪器设备的发展中国：生命科学仪器的落后>技术落后>科学落后科研投入主要用在购买国外的仪器设备，实验试剂;落后的原因与思考

生物研究试剂2012年科技部启动国家重大科学仪器设备开发专项三课程模式

1邀请专家分段授课，教学相长

2理论联系实际；原理与应用相提并论；

3技术与仪器设备相结合

4启迪创新，技术原理与应用拓展；

5课程讲解与讨论，师生互动关键词：科学，技术，试剂，仪器，应用第一章遗传分析与检测

总论现代生物学检测与分析技术讲座遗传学是分析基因型与表型的相互关系表型传递中的基因型关系一遗传分析历史

孟德尔遗传规律遗传分析的开始摩尔根遗传规律的发展遗传因子的染色体学说，基因定位分析根据子代与亲代的遗传与变异进行遗传分析，连锁分析基因定位遗传标记间接分析表型分析推测基因经典的遗传学：从表型推测分析基因型！独立分配

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一对遗传因子的遗传行为

自由组合两对因子的遗传测交图解复等位基因和血型孟德尔遗传学最为接近数学，统计学

表型=基因型+环境

染色体与孟德尔遗传因子减数分裂时染色体的行为与孟得尔遗传因子的传递方式具有平行关系(见书中155页)基因连锁和交换的证据

遗传图距的设想摩尔根与他的学生Sturtevant博士是Morgan教授的学生,他是第一位采用重组与交换的遗传学方法进行染色体基因定位的研究人员.Sturtevant博士设想,如果基因交换是随机的话,那么两个基因在染色体上相距的位置越远,发生交换的机率越大.因此,交换率可用于描述染色体上基因之间的相对距离.遗传图距与遗传图绘制果蝇

2

号染色体部分遗传图,等位基因作用相等吗？

我们一般总是认为等位基因作用相似，至少绝大部分基因是这样，但是越来越多的证据表明，等位基因的作用是不相等的，2个等位基因表达具有随机性，或全部表达，或表达其一，或不等效表达，这是一个很有深意的问题。不妨从我们的家庭中父母的角色和作用思考！遗传分析-基因直接检测

基因直接分析-基于基因测序技术的发展连锁的局限性;

直接检测的优缺点基因检测的单一分析到全基因组分析个体分析与群体分析基因分析回到表型分析;中间表型分析

孟德尔性状－多基因性状－数学模型

DNA通过RNA流向蛋白质中心法则基因转录与表达检测基因的表达调控-多层次,网络mRNA分析关键步骤基因语文的概念定性与定量:

选择性剪切;

影响因素:染色质结构,miRNA,转录因子,表观遗传学:DNA甲基化与转录调控不断变化－实时检测

检测方法Northern杂交与斑点杂交RT-PCR;竞争性RT-PCR实时定量RT-PCR

基因表达谱芯片（逆向点杂交）外显子芯片：选择性剪切高通量RNA测序共同的原理？5‘-Methylcytosine,thefifthbasecytosine5’-methylcytosineNNNH2HONNNH2HOCH3DNMTS-A-Met胞嘧啶的5羟甲基化hm5C其他核酸修饰钱永健改造绿色荧光蛋白，通过改变其氨基酸排序，造出能吸收、发出不同颜色光的荧光蛋白，其中包括蓝色、青色和黄色，并让它们发光更久、更强烈。由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中。光控基因表达！生物物质的光检测YangY,etaal,基因诊断-诊断医学领域革命

基因诊断是指采用分子生物学方法在DNA,RNA水平上对基因及其表达进行分析,对疾病和性状进行诊断和预测.

主要包括:疾病诊断,疾病预测,疾病指导性治疗;疾病治疗预后,疾病风险估计;环境易感预测,性格行为预测;个体鉴定.3个方面：定性；定量；定型。基因突变、基因缺失和插入，基因修饰，拷贝数变异，基因重排，基因多态性，外源基因，转录量，选择性剪切，RNA编辑，miRNA等。外源性标记检测技术同位素标记:灵敏度高

32P,标记DNA;末端标记,合成掺入;替代物:生物素,地高辛标记放大效应;显色反应荧光标记:高灵敏度,实时,FITC,FAM,ROX、TET、HEX、TAMRA,Cy3,Cy5,量子点新型报告基因新型报告基因－sLuc新型报告基因新型检测系统－SEAPFRET原理与应用报告荧光淬灭剂报告荧光发光基因点突变/分型检测的临床意义1.遗传病基因突变中最为常见的是点突变2.肿瘤基因点突变导致癌基因激活或抑癌基因失活;3.病源性疾病因为病原体基因突变导致感染和致病能力不同,例如肝炎分型等.4.个体鉴定,法医鉴定,HLA配型5.人类起源和进化,民族关系,物种鉴定遗传疾病基因诊断（一）病史采集（二）症状与体症（三）家系分析（四）染色体检查

1．染色体检查的指征2．染色体检查技术（五）生化检查

(六)基因检测产前诊断产前诊断主要从遗传/生化/物理三个方面进行：遗传学检查，如细胞培养、染色体检查、基因诊断取胎儿细胞和羊水方法有：（一）羊膜穿刺法（二）绒毛取样法（三）脐带穿刺（四）胎儿镜检查孕妇外周血胎儿细胞富集

循环DNA/RNA1978年YWKan首次利用RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基因诊断

连锁RFLPEcoRISouthern镰型红细胞血友病

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皇室病病源体基因检测

任何病原体导致人类疾病,均涉及到病原体的基因(DNA或RNA),包括病毒、细菌、寄生虫、支原体、衣原体外源性DNA或RNA。检测外源性DNA/RNA存在就可以判定病原体的种类,感染状态以及指导治疗等.目前,临床上这方面运用最为广泛,这在以后重点介绍.

方法:荧光定量PCR,基因芯片等;

特点:快速、简便而准确的诊断；局限性:依赖于外源生物DNA顺序.

病原体的精细分型？病原体的耐药检测？感染性疾病中的应用

对于病原体感染性疾病，以往的诊断是形态学、生化学、血清学等方法，在灵敏度、特异性、诊断速度方面有明显不足：隔一段时间后才出现抗体，不能确定是否有现行感染；必须分离病毒并培养。由于PCR的临床运用,可以快速和灵敏地明确病原体感染种类,从而指导治疗。用基因诊断可检测的病毒有艾滋病病毒、肝炎病毒等。病菌有大肠杆菌、结核杆菌，霍乱弧菌,幽门螺杆菌等;寄生虫与真菌类,衣原体,支原体,等也可用PCR方法检测。基因分型检测技术－STR微卫星DNA－短的串联重复片断人群中高度变异，高度多态性－个体识别，性别、亲缘鉴定，法医鉴定－寻找致病基因（从家系）－寻找人类各种遗传性状基因－民族比较，生物比较，物种关系鉴定，STR技术的发展从VNTR到STR，从杂交到简单电泳从手动银染到荧光自动检测从单一到多元，从STR到SNP结合个体识别－STR试剂盒缺点：高突变率；与表型无关；？解决二相关技术概要

1重组DNA技术基本原理DNA探针,连锁分析构建基因文库,克隆基因;基因多态性/突变的检测,基因诊断表达基因产物生物学检测的各种酶基因治疗

生物学基因检测的基础之一基因扩增与放大技术

PCR技术原理与拓展

神奇的PCR：1变成1000万各种衍生PCR

名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA

单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA

锚定PCR分析具备不同末端的序列增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR有利于产物的分离膜结合PCR去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒PCR产生合成或突变蛋白质的DNA片段连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等

RACE-PCR扩增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色体基因原位PCR研究表达基因的细胞比例等通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型(mapping)同时分析少量细胞的mRNAPCR玩的是技术，是各种变化的酶，是奇思妙想！一直想PCR9段高手可以去定位周边未知序列例如：PB转座子序列LAMP（能实现在短短15－60分钟内，将目标基因扩增10-9～10-10倍，这是所有其他基因扩增方法无法比拟的，产物量多到我们直接肉眼就能鉴别结果，省去了其他基因扩增方法后续结果检测的步骤。它不仅将用于诊断各种人类疾病、动植物疾病，还能有效地运用于进出口货物快速检测。LAMP（环介导等温扩增）技术技术发明人Notomi博士PCR的缺陷：三个变化的温度，仪器要求，人体内恒温也可以进行DNA复制，为什么不可以借鉴呢？“扩增RNA”的NASBA

技术

引物2逆转录酶逆转录酶T7RNA聚合酶逆相RNA扩增物RNaseH引物1引物1延伸

RNaseH

和引物2延伸

RNAT7RNA聚合酶逆转录酶逆转录酶“分子灯塔”杂交AMV-RT(鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA杂交链RNaseH:降解杂交链中的RNAT7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物

3核酸杂交技术

抑制减法杂交(SSH)荧光原位杂交技术（FISH）比较基因组杂交（CGH）逆向点杂交技术（一系列探针固定于膜上）Southern、Northern杂交

基因芯片由此发展而来！

比较基因组杂交技术

(ComparativeGenomicHybridization，CGH）

分别用不同颜色的荧光标记等量的来自待检组和正常组织的基因组DNA（分别称为testDNA和referenceDNA）以及足够量的人类Cot-IDNA(着丝粒DNA)，制备成混合探针，与正常中期分裂相进行染色体原位抑制杂交，testDNA和referenceDNA探针竟争性的与染色体上的靶序列杂交，通过检测染色体上每一位点的testDNA/referenceDNA荧光强度之比，推断待检组织DNA是否发生缺失或复制。优点：1）一次杂交即可对不同组织基因组间DNA序列差异进行检测并定位。

2）仅需正常组织的染色体制片，利于标准化。缺点：

1）不能检测平衡易位、点突变、基因内重排，着丝粒及端粒区。

2）灵敏度不高，缺失大于10-30Mb，复制大于2Mb.发展：

CGH与基因芯片，CNV芯片DNA序列检测与分析技术

测序原理，发展克隆测序PCR测序同位素测序与荧光标记测序平板手工到毛细管全自动测序全基因组测序高通量测序技术

（High-throughputsequencing）高通量测序技术又称“下一代”测序技术，又被称为深度测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和读长较短等为标志。主要有以下几种：454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、ABISOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序等。应用广泛：要敢于想！想到就能够做到！油包水微PCR反应高密度成像技术

基因多态性/突变检测技术

遗传标记：STR，SNP，CNV，插入，缺失，倒位医学领域个体识别技术历史疑案：曹操墓分子分类与系统进化中国渔业谈判；基因差异与疾病每个人的遗传背景是有差异的。构成人体遗传图30亿个核苷酸分子，它们的遗传图谱字母排列的99.9%是相同的，但剩下的0.1%的差别是至关重要的，这些差别称为多态性。其中最为重要的为单个核苷酸多态性(SNP),这些多态性就是每个人区别于其他人的最内在的遗传基础.同时,基因的差异也表现出与疾病的相关性.SNP(SingleNucleotidePolymorphism)

单核苷酸多态性

是人类基因组中最常见的基因多态性，是继RFLP,STR之后的第3代遗传学标记,是个体差异的最基本因素，是功能基因组学、疾病基因组学、药物基因组学和环境基因组学研究重要内容。

短串联重复(STR)多态性及其遗传多基因疾病的风险性分析

开展多基因病的基因诊断，对发病的风险性估计具有一定意义。对于疾病的预防具有重要价值.以老年性痴呆中Alizhemer's病(AD)为例。

ApoE的多态性与AD疾病相关性最为引人注目,ApoE4纯合子患AD的风险性为非ApoE4型的18倍,ApoE4是AD诊断和预后及风险性估计的一个指标.

基因芯片技术

高通量,微量,集成特点杂交原理；

cDNA，寡核苷酸芯片，通用芯片显色方式:荧光标记优势与趋势

基因芯片的主要应用1基因表达检测

人细胞、拟南芥、酵母基因表达等2突变检测

BRCAⅠ基因外显子、CFTR基因、β-地中海贫血、结核耐药突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等3基因组多态性分析

人类基因组SNP和CNV多态性的鉴定及分型4基因文库作图

通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图，替代FISH的基因定位5.基因组大幅变异检测:检测LOH,基因缺少,重复,易位等.6.杂交测序:替代凝胶电泳方法为基础的测序..组份1组份2组份3全组份基因芯片筛选新药

集成电路型将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）细胞遗传学技术染色体核型分析；高分辨显带技术,染色体显微切割技术细胞分子遗传学：FISH，CGH，芯片基因定位，染色体疾病,建立染色体区域特异的DNA文库,基因组物理作图（STS）,遗传毒理分析技术

检测各种致基因突变的物质

1基因分子直接检测低频,复杂,昂贵;2报告基因检测lacZ/X-gal;3表型筛选营养缺陷型;抗性选择等

4直接观察:COMET,DNA电泳,SCE,微核

细胞基因转染与干扰技术

基因转移系统基因功能研究（+/-)

基因治疗这里涉及到一些遗传学的操作。略！基因转染原理将目的基因导入靶细胞,使之表达。涉及到基因，基因表达元件，导入方法，导入细胞，表达检测。导入方法很多，大致可分为：

物理学方法化学方法生物学方法

基因转染载体病毒载体细菌载体反转录病毒载体噬菌体载体腺病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体

EB病毒载体杆状病毒慢病毒嵌合(杂合)病毒载体

非病毒载体磷酸钙转染法DEAE-葡聚糖转染法Poly-brene转染法脂质体介导多聚阳离子聚合物电击法*显微注射法基因枪超声波辅助转染多肽转染技术*基因治疗的基本原理世界首例基因治疗患者

复旦大学进行了世界首次血友病B基因治疗临床试验是我国基因治疗领域的里程碑.

转基因动物技术

基因剔除小鼠与转基因小鼠乳腺生物反应器植物转基因条件性基因敲除小鼠1组织特异性基因敲除；2诱导型基因敲除3特异性基因敲入其他生物的基因敲除1高效的ZFN技术2神奇的TALEN+X技术2基因抑制技术07年以来，最激动人心之技术，长生不老有望！

马牛羊也能变成制药厂转基因动物-转基因羊，鱼转入人凝血因子IX基因的山羊转入牛生长发育基因（bGH)的绵羊转入生长激素基因的鲤鱼，上为转基因鱼，下为对照。避免转基因，也能改良物种！基因打靶与生物克隆体细胞基因打靶,细胞克隆,制备疾病动物模型;转基因动物等.可阅读PPT从疾病到基因基因诊断生物芯片生物克隆与转基因动物基因治疗基因转染载体基因工程与人类健康GFPThanks蛋白质组学的研究进展

提纲

蛋白质组学的产生蛋白质组学研究意义蛋白质组学研究的内容和方法蛋白质组学的发展趋势我国蛋白质组学研究的现状

1995流感嗜血杆菌

1830Kb1997酵母12.7Mb1998线虫

9700Kb2002水稻~430Mb2001人~3Gb2000果蝇137Mb

从基因到蛋白质蛋白质组学的产生蛋白质组(proteome)由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年首次提出,指的是由基因组编码的全部蛋白质。由Cordwell和Humphery-Smith提出的功能蛋白质组指的是在特定时间、特定环境和试验条件下基因组活跃表达的蛋白质，功能蛋白质组是总蛋白荧光染色的细胞内蛋白质质组的一部分。蛋白质组学（Proteomics）是指在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科。

人类基因组计划完成之后，生物学被重新划分为前基因组和后基因组两部分。*科学研究已开始进入“后基因组时代”。主要是开展蛋白质组的研究。*有科学家形象地说道：即使基因测序全部完成，也只好像是一本没有姓名、只有号码的电话簿。“后基因组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一本基因大百科全书。

基因组和蛋白质组到底有什么联系？蛋白质组研究的意义

蛋白质组的研究能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。动物模型/细胞蛋白质组研究生物信息学分析功能分析人类疾病蛋白质组新技术蛋白质组研究的策略：平台与整合蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定ProteolyticdigestionProteolyticfragmentsPureprotein2DelectrophoresisSampleMALDI-TOFCapillaryElectrophoresisHPLCN-AminoacidsequencingMassspectrumLC/MS/MSDatabasesearching蛋白质组研究的支柱：

双向电泳技术生物质谱生物信息学双向电泳技术1.双向电泳技术发展史（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）O‘Farrell1975年创建高分辨率的双向凝胶电泳，对大肠杆菌细胞抽提物双向电泳，分离到1100个蛋白组分。但载体两性电解质使得pH不稳定且重复性差。

1982年Bjellqvist等引入固相pH梯度IPG（ImmobilizedpHgradients)。解决了双向电泳重复性差、阴极漂移、可比性差上样量低等一系列问题。1994年，Rabilloud等用胶内水化的方法进行双向电泳，进一步增加了样品上样量。

1998年，Islam等IPGphor等电聚焦系统的引入大大简化了IPG－IEF，聚焦水化同时进行。

双向凝胶电泳（2－DE）原理:

先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质中进行第一次分离，即等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF），然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳完整的实验步骤包括：样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定

1.样品制备样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来决定具体的实验方法。蛋白样品的有效溶解是成功分离蛋白质的最关键的因素之一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏。可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。

2.第一向：等电聚焦凝胶电泳（isoelectricfocusinggelelectrophoresis,IEF）

等电聚焦是将蛋白质样品加载到pH梯度介质上进行电泳，在电场的作用下蛋白质会向与其所带的电荷相反的方向泳动，直到迁移到其等电点位置时，其净电荷为零，在电场中不再移动。这样根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦到一个很窄的pH介质区域内而实现分离。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10PROTEANIEFCell等电聚焦电泳仪是Bio-Rad公司1999年推出的一维高电压等电聚焦电泳，这款电泳的设计主要体现了蛋白质组工作系统对一维电泳高容量，高分辨率，重现性好等的要求。电压范围：25~10,000V电流范围：2.4mA温控范围：10-25℃，内置Peltier半导体制冷，精确控温。胶条容量：容纳24个7cm胶条，12个11、17、18、24cm胶条聚焦槽：7、11、17、18、24cmPROTEANIEFCell等电聚焦电泳仪ReadyStripIPGstrips（IPG胶条）IPG胶条

IPG胶条使用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，并可制成任意的pH梯度。可根据不同的分离目的来选择不同的pH梯度范围。

线性宽pH梯度胶条（pH3-10）尽管可以在同一块凝胶上显示样品中绝大多数的蛋白质，但多数蛋白质都集中在胶条的中部，使得中间的分辨率较低。非线性宽pH范围胶条（pH3-10）是将pH4-8之间的距离相对拉大，两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好的分离大部分PI为4-8的蛋白质。窄范围重叠pH梯度胶条（pH3-6,5-8,7-10）可以大大提高分辨率和灵敏率。微范围pH梯度胶条（pH3.9-5.1，4.7-5.9，5.5-6.7，6.3-8.3）能进一步提高凝胶的分辨率，尤其适合于低丰度蛋白的检测。

3.平衡从第一向电泳转移到第二向电泳的过程包括两步：一是将已等电聚焦的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡；二是胶条包埋在第二向凝胶的顶部。平衡的作用是保证蛋白质完全被SDS包裹，半胱氨酸被还原且被烷基化。平衡分为两步：平衡液1（尿素6M，SDS2%,Tris/HCL0.05M，甘油20%，DTT2%）作用是还原蛋白的巯基，平衡液2（尿素6M，SDS2%,Tris/HCL0.05M，甘油20%，碘乙酰胺2.5%）作用是蛋白巯基烷基化。4.第二向：SDS

双向电泳第二向是将在IPG胶条中经过第一向等电聚焦分离的蛋白质转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量的不同与第一向垂直进行分离。在二向中SDS-聚丙烯凝胶电泳中凝胶的组成可以是均一胶（单一浓度的丙烯酰胺），也可以使用梯度胶（丙烯酰胺的浓度自上而下逐渐增高）。两者各有优缺点。其中均一胶可以很好的分离分子量范围较窄的蛋白质样品。梯度胶可以同时分析分子量范围很宽的蛋白质；同时随着凝胶浓度梯度的升高凝胶孔径的缩小，分离的蛋白质点更为清晰。

+–pH3pH7.5pH10PROTEANIIxiCell（垂直板电泳仪）5.染色有机染料、银染、负染、胶体扩散染料、荧光染料、金属螯合染料双向电泳中蛋白质的检测通常是用普通染料或金属染料来检测凝胶中的蛋白质。染色的灵敏度与许多因素相关，包括与蛋白质结合的染料数量；染色的强度；凝胶上的蛋白质与凝胶背景之间的染色差异等许多方面。其中考马斯亮蓝染色是检测蛋白质最常用的方法，CoomassieBrilliantBlueR-250检测的灵敏度为40ng。银染方法也有许多种，尽管在化学作用上有一些差异，但却具有相似的灵敏度，可以达到1ng。

凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立PDQuest图像分析蛋白质组学具有大量的数据信息，图像分析软件是进行复杂二维电泳凝胶分析不可缺少的工具，主要用于分析不同凝胶之间差异蛋白，并控制切胶系统获取差异的蛋白用于进一步分析。

Bio-Rad公司推出的PDQuest分析软件含5种功能：成像系统控制功能+二维凝胶分析功能+数据库管理功能+SpotCutter切胶系统控制功能+质谱数据反馈功能。

蛋白胶切取系统

蛋白切胶系统是一套自动切胶系统，通过CCD成像，并调用分析软件获得的分析结果，自动准确的从凝胶切获取蛋白点，并将之存放在96孔板中，以便进行下一步研究工作生物质谱（massspectrometry）技术

原理：在样品离子化后，根据离子质荷比的不同进行分离并确定分子量，具有灵敏度高准确度高易于实现自动化等优点。

在80年代早期出现了两种新的离子化技术，使质谱从仅能分析小分子挥发物到可以研究生物大分子*基质辅助激光解析离子化（MALDI）*电喷雾离子化（ESI）这些技术能非常快速和准确的测定大分子物质，结合各种质谱技术后，可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白质的研究开辟新道路。质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程

样品制备

与IPG胶条水化

IPG电泳与上样缓冲液浸润

SDS

转PVDF膜

胶内直接染色

染色

取出蛋白点

胰酶等消化

浓缩于多孔吸附柱上

MALDI-MS肽指纹图

数据库查询

蛋白质鉴定

已知

反向HPLC分离

MALDI-MS，PSD片段分析未知

ESI-MS-MS、微测序

质谱法测序

1.肽段质量指纹图谱（PMF）

步骤：蛋白被蛋白酶专一性酶解后，用质谱检测生成的肽段，形成由各肽段质量组成的质谱图，将得到的质量谱图与数据库中通过计算得到的理论谱图进行比较，进行鉴定。

代表方法：

2DMALDI-TOF

Proteomics2004,4,619-626.

J.Biotechnol.2003,106,147-156.J.MassSpectrom.1998,33,1-192.多肽片段指纹图谱（PFF）

步骤：用酶专一性酶解蛋白质，经过分离，得到的肽段在质谱中被选择和破碎后得到MS/MS谱图，与数据库中的谱图比较进行鉴定

代表方法：

LC-ESI-MS/MS2D-LC-MS/MS（shotgun）

Proteomics2004,4,619-626.

J.Biotechnol.2003,106,147-156.J.MassSpectrom.1998,33,1-19生物信息学在蛋白质组学研究中的作用J.Biotechnol.2003,106,147-156.生物信息学在蛋白组研究中的应用1.编码的DNA序列的寻找与分析（分析研究对象）；2.蛋白质序列信息的获取（搜索与测序）；3.蛋白质鉴定和性质预测;4.蛋白质序列分析；5.蛋白质结构和功能预测；6.数据的分析与整合：大范围基因表达分析；蛋白-蛋白相互作用；蛋白在细胞内的定位；构建通路和细胞系统；预测和发现新的知识。蛋白质鉴定和性质预测蛋白质鉴定：1.检索工具和算法：PMF——MS-Fit（Prospector的一部分）、ProFound、Mascot；PFF——Mascot、SEQUEST、Emowse（EMBOSS软件包）。2.网络鉴定工具:AAComldent工具www.expasy.ch/tools/aacompPeptideMass工具www.expasy.ch/tools./peptide-mass.html

3.数据库资源：PIR-PSD：/pirwww/SWISS-PROT：/sprot

……编码的DNA序列的寻找与分析找寻DNA的开放阅读框翻译编码区工具：美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的“ORFFinder”

欧洲生物信息研究所（EBI）提供的Proteinmachine

www2.ebi.ac.uk/translate/其它资源1）美国国家生物技术信息中心（NCBI）：GenBank核酸序列数据库,

/genbank；2）欧洲生物信息研究所（EBI）：欧洲分析生物学实验室核酸数据库（EMBL）,

www.ebi.ac.uk；3）日本国立遗传学研究所：日本DNA数据库（DDBJ）,

www.ddbj.nig.ac.jp。双向电泳的局限性a.低拷贝蛋白的鉴定：目前的技术还不能检测出拷贝数低于1000的蛋白质b.极端酸性和极端碱性的蛋白c.分子量过大（大于100KD）或过小（小于10KD）的蛋白质不适合用这一方法d.一些疏水性蛋白，由于不能溶于提取液而不适合2-DEc.目前不能实现自动化处理，得到高质量的双向电泳图需要精湛的技术我国蛋白质组学的现状和发展趋势国内在1997年开始开展蛋白质组研究

2000年中科院上海生化所发表了我国第一篇蛋白质组研究论文，并建立了我国第一个大型的蛋白质组数据库并实现了网络共享2001年军科院和湖南师大相继发表了蛋白质组研究论文2002年11月，在法国凡尔赛召开的首届人类蛋白质组国际大会上，贺福初院士当选为“人类肝脏蛋白质组研究计划”执行主席，这是我国领导的一项重大国际合作计划，也是第一个人类组织器官的蛋白质计划，具有重要的现实意义与重大的战略意义。

实例样品：结核杆菌1.菌体蛋白的制备菌体在含有1mMPMSF和10mMEDTA的MilliQ中重悬超声破碎裂解菌体15分钟，功率为200瓦，超1秒停2秒向超声裂解物中加入尿素、二硫苏糖醇、辛葡糖酐、两性电解质终浓度分别为9M、70mM、2%和0.2%。室温放置30分钟，10000g，15分钟。蛋白浓度的测定，分装冻存。2.等电聚焦程序（17cm胶条）水化主动水化50V12hS1除盐快速250V1.5hS2除盐快速1000V2.5hS3升压线性8000V5hS4聚焦快速8000V80000VhS5保持快速500V任意时间

3.SDS胶浓度为12%，上样量为100ug。电泳时保持恒流状态。4.银染固定、水洗、敏化、水洗、染色、显色、终止5.扫描和软件分析展望

蛋白质组学是针对蛋白质组研究的一门新兴学科,是人类基因组计划完成后生命科学最活跃的领域之一,近年来发展迅速,其相应的方法学也取得了巨大的进步。双向电泳-质谱技术虽然一直是蛋白质组学的核心技术,但是近年来一系列新技术新思想融入了蓬勃发展的蛋白质组学技术当中,极大的促进了这门新兴学科在生命科学各个领域的应用。1、质谱显像(MassSpectrometryImaging,MSI)技术

质谱显像技术是利用基质辅助激光解吸/离子化质谱,直接确定新鲜冰冻组织切片的多肽或蛋白的新技术,也被称为原位蛋白质组学。通常该技术可以在组织的任意位置检出400个以上的蛋白信号。MALDI质谱显像既有质谱设备的高敏感性全部优点,又具有同时检测混合物中多种成分的能力,基本无需考虑化学性质和分子质量。质谱成像技术正在快速应用于许多领域。2多维液相色谱(MultipleDimensionLiquidChromatography,MDLC)

将蛋白抽提物变性酸化强阳离子交换柱根据各肽段的电荷差异进行分离反相层析柱电喷雾离子化质谱仪(ESI-MS)

这一过程反复进行,从而得到由样品产生的多肽混合物中各肽段的肽指纹图谱,结合数据库搜索即可得到样品的蛋白组成。感兴趣的肽段还可以在通过源后裂解或碰撞裂解直接得出序列信息,实现分离和鉴定一次完成,达到对复杂多肽和蛋白样本的有效分析和在线检测。3核素标签色谱核素标签色谱是液相色谱-质谱技术与核素示踪技术相结合的分离方法,主要用于定量分析差异表达蛋白。广泛应用的是同位素亲和标签(Isotopic-codeaffinitytag,ICAT)

。此法敏感度高,低表达蛋白分析准确性好。ICAT是一种人工合成的有机分子,一端是起亲和标签作用的生物素,另一端为可与半胱氨酸发生特异性反应的活性基团。ICAT技术利用巯基标记,所以只能对含半胱氨酸残基的蛋白质进行分析是其不足之处。目前ICAT方法又衍生了多种新的方法,如定量研究蛋白质磷酸化的磷酸化蛋白亲和标签、大规模研究N-末端糖基化的糖基化定点标签、分析蛋白质丰度的串联质量标签等。蛋白质芯片技术蛋白质芯片(Proteinchips)

技术是一类高通量、微型化分析蛋白质表达和蛋白功能的新型分离及鉴定技术。可分为生物化学型芯片、化学型芯片和缩微芯片三类。SELDI蛋白质芯片技术：表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface

enhancedlaserdesorption/ionizationtmieofflightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)

依其检测目的将表面修饰为化学和生物两种类型,前者包括:疏水表面芯片、亲水表面芯片、阳离子表面芯片、阴离子表面芯片和金属离子螯合表面芯片及混合芯片等6种;后者分为抗体-抗原表面芯片、受体-配体表面芯片、酶-底物表面芯片和DNA–蛋白质表面芯片等种类,可特异性地用于检测对应的蛋白质分子。(1)待测样本来源广,如血清、尿液、体液等,不需要特殊处理,直接点样检测;(2)样品用量极少,每次0.5~5ul或2000个细胞的超微量样本,且范围广(0.5~400ul);(3)可检测的分子量范围很广,而且特别20kDa以下的蛋白；(4)可进行小型实验或高通量检测，每次测8、24、96或192个样品,可满足临床检测、普查或大样本筛查的需要;(5)检测速度快,一条8孔芯片的阅读时间为3~5min;(6)携带的分析软件可以迅速发现各种疾病特异性变化的差异蛋白质,用于发现与疾病相关的一种或一组生物标记物,提供疾病诊断的最佳组合指标。5化学喷墨印迹

化学喷墨印迹是一种结合了2-DE技术和蛋白质芯片技术双重优点的新型技术,直接将2-DE分离结果转印到膜上,形成一个固相蛋白质阵列,然后利用特殊装置对选定的蛋白质点微小部分进行原位消化,无接触式微量喷进质谱完成分析。该方法省去了2-DE分离后胶内酶切的多个步骤,而且经2-DE分离的蛋白质可以应用多种酶消化,联合进行蛋白质序列的鉴定。化学喷墨技术是发现新的诊断标记物和药物靶点的重要工具。进展之一：荧光染色SyproRubystained2D-gel,brainproteinsDIGE尽管一些可选择的或互补的蛋白质组学技术正在发展，如同位素亲和标签和多维蛋白质鉴定技术，但双向电泳仍是当前仅有的可以同时分离大量的复杂的蛋白质混合物的关键技术。DIGE系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS凝胶图像。样品制备实验设计凝胶成像统计分析荧光染料标记的蛋白质比未标记的蛋白质在分子量上有明显的迁移(CyDye

染料的分子量和疏水性影响的双向电泳过程中蛋白质的迁移)，大部分未标记的蛋白在标记蛋白的偏下方，可能导致要切取目标蛋白点的污染。因此，在切取目标蛋白质点进行质谱鉴定前，需要跑一块斑点切取胶进展之一：结果自动分析BioRad'sPDQuest.Simultaneousanalysisof100gelsorcompositegelsusingBioRad'sPDQuest.(Courtesy:BioRadlaboatories)进展二：二维毛细管电泳

一维：等电聚焦毛细管电泳二维：区带毛细管电泳进展之三：微流控芯片二维电泳（MECK－CE）

1990年首次提出微全分析系统概念以来,微流控芯片技术得到迅速发展。微流控芯片技术是在分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料学及生物学的基础上发展起来的。相对于毛细管而言,微流控芯片具有上样量更少,进样方式更加智能化,分离时间更短等优点。发展之四：多维电泳按等电点、质荷比和分子量分离蛋白质，理论上可分离3万多种蛋白质

与平板二维电泳相比，多维电泳可将灵敏度和精密度提高100倍,峰容量提高5倍小结蛋白质组学的产生蛋白质组学的主要研究方法—双向电泳蛋白质组学的进展

谢谢！谢谢I.Proteincrystallization胡小健副教授复旦大学生命科学学院X-RayCrystallographyStructuredetermination184OverviewofX-rayDiffraction185ProteinDataBankMoleculeTypeProteinsNucleicAcidsProtein/NAComplexesOtherTotalExp.

MethodX-ray45620113720851748859

NMR680184514477797

ElectronMicroscop/p>

Other110449127

Total52686

2002

2292

33

57013

186AbriefhistoryofX-raysIn1895,G.C.Röntgendiscoveredmysteriousrayscapableofpassingthroughthehumanbody.Becauseoftheirunknownnature,hecalledthemX-rays.X-raysareactuallyelectromagneticwavessituatedbetweenultravioletlightandgammaraysonthewavelengthscale.Theirwavelengthiscomparabletointeratomicdistances.In1912M.vonLaueandP.KnippingobtainedthefirstdiffractionpatternofacrystalusingX-rays.In1953,thestructureofDNAwassolvedbyJ.Watson,abiologist,andF.Crick,aphysicist,thankstotheuseofX-rays.Röntgen

187Beforethefirstproteincrystalstructure1895:W.C.RoentgendiscoversXrays1912:MaxvonLauediscoversX-raydiffractionbycrystals1913:W.L.BraggreportsthecrystalstructureofNaCl,providingthefirstexperimentalevidencefortheabsenceofsalt"molecules“1928:KathleenLonsdalereportsthestructureofbenzeneashavingsixequalsizedbondsinsteadofalternatingdoubleandsinglebonds1935:J.M.Robertsonetal.solvethestructuresofpthalocyanins,thefirstcaseofacomplexorganicmoleculesolvedindependentlybycrystallography1948:Bijvoetetal.solvestrychnine,perhapsthefirstcaseinwhichcrystallographydecidedbetweenalternativesproposedbyorganicchemists1950:Bijvoetetal.establishtheabslouteconfigurationsofdextroandlaevocompoundswithNaRbtartrate1949-57:DorothyCrowfootHodgkinetal.solvedthestructuresofpenicillin(1949)andvitaminB-12(1957).ShewontheNobelPrizeinChemistryin1964188EarliestSolvedMacromolecularStructures1958:Myoglobin,spermwhale,Kendrewetal.1962:MaxFerdinandPerutzandSirJohnCowderyKendrewwintheNobelPrizeinChemistryfortheirstudiesonthestructuresofgloblularproteins.1965:Lysozyme,heneggwhite,Phillipsetal.1967:Ribonuclease,twoindependentsolutionsreported.ForribonucleaseS,byF.M.RichardsandH.W.Wyckoff.RibonucleaseAstructurebyKartha,Bello&Harker.1968:Haemoglobin2.8ÅsolutionreportedbyPerutzetal.1971:InsulinbyBlundelletal.1971:ProteinDataBankestablishedatBrookhavenNationalLaboratory,Upton,LongIsland,NewYork.In1972,theProteinDataBankcontainedtwostructures.1974:TransferRNA,yeast,phenylalanine,byRichandbyKlug.189CrystalProteinCrystal1903typesofcrystal191ProteinCrystal192HowDoProteinsCrystallize?ForcrystallizationtooccurithastobeenergeticallyfavorablePrecipitantsremoveavailablewaterforcingproteinstoassociatewitheachotherWaterProteinPEGs193Asarule,proteinsolubilitywillusuallyincreaseasyouaddsalttoyouraqueoussolution,thenbegintodecreasewhenthesaltconcentrationgetshighenoughtocompetewiththeproteinforhydration(interactionwithwatermolecules).DiagramfromthewebsiteofAlanClark,VictoriaUniversityofWellington,NewZealandhttp://www2.vuw.ac.nz/staff/alan_clark/teaching/index.htmHbCOsolubilityasafunctionofionicstrengthinthepresenceofseveraldifferenttypesofsaltsSolubility194Proteinsolubilitycurve195toaddmoreofasubstance(toasolution)thancannormallybedissolved.Thisisathermodynamicallyunstablestate,achievedmostofteninproteincrystallographybyvapordiffusionorslowevaporationtechniques.Zone1-Metastablezone.Thesolutionmaynotnucleateforalongtimebutthiszonewillsustaingrowth.Itisfrequentlynecessarytoaddaseedcrystal.Zone2-Nucleationzone.Proteincrystalsnucleateandgrow.Zone3-Precipitationzone.Proteinsdonotnucleatebutprecipitateoutofsolution.DiagramfromthewebsiteforTheUniversityofReading,CourseFS460InvestigatingProteinStructureandFunctionSupersaturation196ProteinCrystalandPrecipitationProteincrystalsareprecipitatedproteininsolutionsYoucanthinkofthemhighlyconcentratedaqueoussolutions(usuallyabout500mg/ml)AmorphousprecipitationisrandomCrystalsareorderedThisisthepropertyweareinterestedinGrayareas!CrystalsPrecipitationCrystalline197[Protein]SolubilitySupersaturationMetastabileUndersaturatedFigure3.3PhasediagramConcentratesolutionenoughsonucleationoccursinonlyafewcasesInitialgrowthpullssomeproteinoutofsolutionReducing[protein]backintometastablerangeGrowonlyafewlargecrystalsBasicconcept:Nucleation&Growth198Fromprecipitatetocrystals–OstwaldripeningDay6Day10Day13Day16199MethodstogrowcrystalsDialysisHangingdropSittingdrop200Han