DB15T 2832-2022旱獭源性成分检测 实时荧光PCR法

ICS67.120.01

CCSB45

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2832—2022

旱獭源性成分检测实时荧光PCR法

Real-timePCRmethodfordetectionofprairiemarmots-derived

materials

2022-12-08发布2023-01-08实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2832—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。

本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、杨帆、郝静云、包勇敢、荆文魁、张志峰、常鸿、赵治国。

I

DB15/T2832—2022

旱獭源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了动物源性产品中旱獭源性成分实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中旱獭源性成分的鉴定，灵敏度为

0.001ng/L。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

实时荧光PCRreal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)

DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

1

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5试剂与材料

水：符合GB/T6682的要求。

引物对序列:

a)上游：5′-CCCTATTAATCTTAACAGCA-3′；

b)下游：5′-GGGATTAGAGTAGCTTCA-3′；

c)探针序列：5′-(FAM)-TATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCA-(TAMRA)-3′。

DNA提取试剂盒。

CTAB。

Tris-HCl(pH8.0)。

NaCl。

EDTA。

蛋白酶K溶液(20mg/mL)。

三氯甲烷。

异丙醇。

75%乙醇。

实时荧光PCR预混液。

阳性对照样品：采用已知含有旱獭源性成分样品的DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录B。

阴性对照样品：采用已知不含有旱獭源性成分样品的DNA。

空白对照：ddH2O。

6仪器与设备

实时荧光PCR仪。

高速台式离心机（最高转速12000rpm）。

旋涡振荡器（最高转速3000rpm）。

核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

恒温水浴锅。

天平（感量0.01g）。

单孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。

7实验方法

DNA提取

参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。

当DNA浓度吸光度值A260/A280在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、

阳性及空白提取对照。

实时荧光PCR检测

7.2.1反应体系

反应体系体积为25.0L，见表1。

2

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表1旱獭源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系

试剂名称贮备液浓度mol/L反应体系体积L

PCR反应预混合液—12.5

上游引物（F）10.01.0

下游引物（R）10.01.0

探针（P）10.01.0

模板—2.0

ddH2O—补足至总体积为25.0

检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。

7.2.2反应条件

预变性：95℃，10min；变性：95℃，15s；延伸退火：54℃，1min，40个循环。在54℃时

收集荧光信号值。

8结果判定与表述

质量控制

质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：

a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；

b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值大于等于40.0；

c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值小于等于35.0。

结果判定

8.2.1质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值大于等于40.0，可判定被检样品为阴性。

8.2.2质控对照成立条件下，2个平行样检测结果Ct值小于等于35.0，可判定被检样品为阳性。

8.2.3对照成立条件下，至少1个平行样检测结果Ct值35.0～40.0，并出现典型的扩增曲线，此时

应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct值小于40.0，并出现典型的扩增

曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果Ct值大于等于40.0，可判定被检样品为阴性。

结果表述

8.3.1结果为阳性者，表述为“检出旱獭源性成分”。

8.3.2结果为阴性者，表述为“未检出旱獭源性成分”。

9防止交叉污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。

3

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A

A

附录A

（资料性）

溶液配制及提取方法

A.1溶液配制及提取方法

将5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用盐酸调pH8.0

后，定容至250mL，115℃高压15min。

A.2CTAB-沉淀液

称0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高压15min。

A.31.2mol/LNaCl溶液：

称取28gNaCl，定容至400mL，115℃高压15min。

A.4DNA提取方法

A.4.1称取样品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12L～20L蛋白酶K（根据

CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65℃至少1h(过夜孵育最好)，如

样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1mL，最多10mL。

A.4.24000rpm/min～5000r/min离心10min。

A.4.3将上清（约1mL）加入无菌EP中（2mL管），加入700L氯仿，涡旋30s后，再12000rpm离心

10min。

A.4.4取上清600L～650L加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1

min。

A.4.512000rpm离心10min，去上清。沉淀溶解于350L的1.2mol/LNaCl溶液。（2管合并共用350

L溶液）。

A.4.6加入350L氯仿，涡旋30min，12000rpm离心10min。

A.4.7取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20m

in，12000rpm离心10min，去上清，沉淀用500L75%的乙醇洗涤，再12000rpm离心10min。

A.4.8去上清后，干燥沉淀，60℃下15s～20s（开盖倒立）。

A.4.9将沉淀溶于100L灭菌水或TEbuffer或DEPC水中。

4

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B

B

附录B

（规范性）

旱獭源性成分的目标扩增序列193bp

CCCTATTAATCTTAACAGCATGACTTCTACCCCTTATAATTATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCAAGAGCCATTAATC

CGAAAAAAGCTATATATTCTTATATTAATCTCATTACAATTCTTTCTAATTATAACTTTTTCTGCCACTGAACTAATCAT

ATTCTATATCCTATTTGAAGCTACTCTAATCCC

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。

本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、杨帆、郝静云、包勇敢、荆文魁、张志峰、常鸿、赵治国。

I

DB15/T2832—2022

旱獭源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了动物源性产品中旱獭源性成分实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中旱獭源性成分的鉴定，灵敏度为

0.001