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文档简介
高效毛细管电泳技术
中国科技大学生命科学学院施荣华
办公室电话63607433邮箱rhsh@“工欲善其事必先利其器”
有了回旋加速器,核物理学才有了进展有了扫描隧道显微镜,才有纳米科学的发展与诺贝尔奖有关的技术发明2014年埃里克·贝齐格等在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就2008年美国钱永健等发现和改造了绿色荧光蛋白2002年日本人田中耕一等发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法,建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析1993年,美国凯利·穆利斯发展了以DNA为基础的化学研究方法,开发了聚合酶链锁反应(PCR)1948年瑞典人阿尔内·蒂塞利乌斯对电泳现象和吸附分析进行深入研究,分离了血清蛋白的几种主要成分前言电泳带电物质在电场中的泳动
毛细管电泳被分离物质在毛细管中的电泳高效毛细管电泳高效率高度自动化的毛细管电泳高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)
作为90年代最重要的分离分析手段之一,HPCE是当今分析化学和分析生物化学的公认前沿。HPCE技术的诞生象征着人类开始进入纳米技术时代。其涉及范围包括诸如物理学、化学、电子学、光学、计算机科学等众多学科和领域。前言HPCE的发展历程:
•
1808年俄国物理学家VonReuss首次发现电泳现象;
•
1937年,
瑞典的蒂塞利乌斯(Tiselius)将电泳发展成为一种分离技术,因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖;
•1981年Jorgenson和Lukacs发展的现代毛细管电泳技术首次在75微米口径的毛细管内分离氨基酸,理论塔板(表示分离效率的参数)数达到40万;【理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2】
•1988年第一台自动化的毛细管电泳仪问世;
•HPCE与其它技术联用:CE-MS、LC-CE、CITP-CE等。HPCE能做什么???HPCE号称万能分析仪器,可以分离各种不同的样品,包括:肽类、蛋白、核酸、离子、手性化合物和药物。各种化合物的定量定性分析分子相互作用细胞分析毛细管区带电泳分离多肽混合物:
UV:214nmV:25KV
Buffer:硼酸盐PH:6.5
蛋白等电点测定生物碱标准样品定量
碳酸胺缓冲液:50mmol/L检测波长(PDA):308nm
无涂层毛细管:50cm电压:15KVPH:6.8
分子间相互作用的鉴定-------结核相关蛋白与铜离子络合分析
下左图,未加铜离子的分离
下右图,加铜离子络合后的图谱毛细管电泳分析Hela细胞,左图为新鲜的细胞,右图为凋亡后的细胞,分离buffer为硼酸和硼砂缓冲液,PH8.0实物图HPCE的结构•
仪器结构HPCE的结构•毛细管柱
材料:要求1化学、电学惰性,2导(散)热性强,3紫外-可见光透光性,4柔韧性,高强度,价廉。常用材料为熔融石英,外层涂聚酰亚胺;新材料有聚四氟乙烯(散热性不好)。内径:25
—75m外径:350—400m长度:50cm左右Ki’1、内可容纳毛细管的制冷剂管道2、毛细管
3、UV和PDA检测窗口
4、LIF检测窗口检测系统检测原理:1利用化合物对紫外光有吸收,将吸收光信号变为电信号传送给计算机,由计算机制作成电泳图而被分析42利用化合物对特定发射光具有吸收而产生激发光,由激光诱导荧光检测器完成。检测器选择紫外/可见光检测测器(UV/VIS)二极管阵列检测器(DAD)激光诱导荧光检测器(LIF)HPCE的结构•进样系统流体力学方式:进样端加压、毛细管的出口抽真空、利用虹吸现象。进样量不受样品基质的影响。一般进样长度不超过有效长度的1%电动方式:
用样品换缓冲液并加电压(分离场强的1/3—1/5)。对离子型组分有进样歧视
.
(正负离子不一样)但适合于粘性介质或
凝胶电泳时使用。HPCE的结构•高压系统
HPCE采用高电压(10—30kV)加在毛细管两端以产生高电场强度(100—500V/cm)。加大电压可缩短电泳时间,提高分离度,使峰形变窄。HPCE的结构HPCE的分离模式•毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,
CZE)•胶束电动色谱(micellarelectrokineticchromatography,MEKC)•毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,
CGE)•毛细管等电聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)•毛细管等速电泳(capillaryisotachophoresis,
CITP)•毛细管电色谱(capillaryelectrochromatography,
CEC)•亲和毛细管电泳(affinitycapillaryelectrophoresis,
ACE)•电动色谱(electrokineticchromatography,EKC)•非水相毛细管电泳(non-aqueouscapillaryelectrophoresis,
NACE)毛细管区带电泳CZE是HPCE是最简单的一种方式,主要原因是在CZE中毛细管内只充入单纯的缓冲溶液,溶质以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。由于电渗流(EOF)的存在,正、负离子都可以用CZE来分离,中性溶质本身在电场中不移动,随EOF一起流出毛细管。
毛细管区带电泳由于操作简单、多样化,毛细管区带电泳(CZE)是目前应用最广的一种方式,CZE的应用范围很宽,包括氨基酸分析、多肽分析、离子分析、广泛的对映体分析和很多其它离子态物质的分析。例如,在蛋白质分析领域,CZE被用来进行蛋白质的纯度鉴定、肽谱分析、等。毛细管区带电泳原理:基于各被测物净电荷与质量比存在差异。不同离子表面电荷密度的差异使其以不同的速度在电解质中移动,最后达到分离。应用:CZE成为目前应用最广泛的一种模式,适用于蛋白质、氨基酸、多肽、对映体和离子等的分析。关于电渗流毛细管电泳所用的毛细管是由石英玻璃拉制的,在水溶液中由于硅烷醇基团(硅羟基)离子化作用,使其内表面带负电荷,于是管壁和电解质界面上形成双电层,在外加电场作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地向阴极流动,形成电渗流(ElectroosmoticFlow,EOF)。
电渗流的作用
可以同时分离正负离子,带电粒子的电泳速度是矢量相加的结果蛋白质定量定性分析肽谱分析使用合适的酶消化蛋白质,使之产生特定的一系列酶切肽段,在毛细管中就会分离出对应的图谱,这就是肽谱,可以大致鉴别蛋白质的结构(类似的原理可以推广到中药的指纹图谱分析)毛细管区带电泳如何提高分离效率?--------选择性和添加剂的使用选择性,即对溶质迁移的先后顺序进行人为的干预,是由产生分离的机理所决定的,控制选择性能够提高分离度并且获得确证的辅助性信息。毛细管区带电泳缓冲溶液的选择
操作缓冲溶液的选择对于任何形式的HPCE的成功分离都是非常重要的。EOF对于pH的改变很敏感(但EOF本身的改变只会使迁移时间和分离度发生变化而不会影响出峰的顺序。
),所以要求使用缓冲溶液以维持恒定的pH。缓冲溶液的有效缓冲范围是pH在pKa±1的区间内。毛细管区带电泳在HPCE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液:·在所选的pH范围内有较强缓冲能力;·在检测波长处有低的紫外吸收;·小的淌度(即大体积、低电荷离子)以降低所产生的电流(避免发热)。一些常用的缓冲溶液及其pH使用范围见表13。那些被称为生物“优良缓冲液”的(如Tris,borate,histidine,CAPS等)特别有用,因为这些缓冲溶液中的离子一般较大,能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流,但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。
毛细管区带电泳缓冲溶液的pH
当溶质的pI相接近时,如多肽和蛋白质,调节pH对分离特别有用。在pH高于或低于溶质的pI值操作会使其所带电荷改变,(高于PI则带负电荷)从而使得溶质在EOF之前或之后进行迁移。当pH低于pI时,溶质带净的正电荷而向阴极迁移,在EOF之前流出;当pH高于pI时则相反。由于溶融石英毛细管化学稳定性较好,pH应用范围可以从2~12,但是在实际应用时,通常要受到溶质的pH稳定性所限。不同的缓冲液PH对分离的影响(提高PH影响蛋白2和3的出峰顺序)毛细管区带电泳
除了影响溶质所带电荷以外,pH的改变还伴随着EOF的变化,因此需要对分离重新进行优化。例如在某一较低pH下,溶质间有没有足够的分离度,但pH提高后改变了溶质所带电荷,EOF也可能增大以至于溶质还未被分离就随之流出毛细管,在这种情况下,可以增加毛细管的有效长度,或者利用添加剂降低EOF,或者干脆用涂层毛细管来消除EOF。
毛细管区带电泳表面活性剂
表面活性剂(如SDS)是HPCE中使用最多的一种缓冲溶液添加剂,在CZE中可以使用多种类型的表面活性剂(阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型)。在临界胶束浓度(CMC)以下,离子型表面活性剂单体能够作为疏水性溶质的增溶剂,还可形成离子对或者作为毛细管内壁改性剂。表面活性剂单体以两种机理与溶质发生相互作用:表面活性剂分子的带电端与溶质亲水端的离子相互作用和/或其烷基链与溶质疏水端之间的疏水相互作用。
毛细管区带电泳
除了与溶质发生相互作用以外,很多表面活性剂还会吸附在毛细管内壁,改变EOF从而大大减小溶质在管壁的吸附。根据表面活性剂所带电荷不同,EOF可能增大、减小或者反向。例如在缓冲溶液中加入阳离子表面活性剂如CTAB使EOF反向。CTAB单体分子通过离子性相互作用结合到毛细管内壁,它们与自由CTAB分子间由于存在着疏水相互作用而使后者带正电端远离管壁。表面活性剂浓度超过CMC将改变分离机理,形成
HPCE的另一种分离方式MEKC,随后将讨论它。
毛细管区带电泳手性选择剂等
手性分析在药物和食品工业中正变得日益重要。目前手性分离主要是利用HPLC和GC进行,复杂而难以令人满意,而且手性固定相常常是很昂贵的。与使用手性固定相相比,利用CZE进行手性分离非常简单,只需要在操作缓冲溶液中加入手性选择剂,如环糊精、冠醚、胆汁盐、Cu(Ⅱ)一天冬氨酸络合物等。CE分离的高效率使其只需要少量的手性添加剂。毛细管区带电泳
选择性的调整可以通过调节手性添加剂的类型和浓度来实现,也可以加入修饰剂,如醇类、尿素和金属离子来实现。CZE已成功地用于分离D型和L型氨基酸以及手性药物、位置异构体等物质。环糊精(CDs)也可用于分离疏水性的非手性物质,如多环芳烃。毛细管区带电泳CDs是应用最广的手性选择剂,它是非离子型的包含六、七、八个葡萄糖基单元的环状低聚糖,分别叫作α-、β-、γ-CDs。CDs是一个两端开口的环状空腔结构,空腔直径由组成它的葡萄糖基的数目决定,空腔内壁呈弱的疏水性而外表面是亲水性的,空腔周围带有手性的二级醇羟基。CDs的手性识别是基于溶质的疏水部分进入到疏水性的空腔内,而亲水部分与手性的二级醇羟基形成氢键。不同的CDs衍生物,如羧烷基衍生物、丁二酰衍生物和可溶性的离子型聚合物,都可以用来改变选择性和提高检测性能。毛细管区带电泳温度尽管毛细管恒温的主要目的是维持恒定的温度以散逸焦耳热,温度也可以作为一个优化CZE分离的参数。当然保持恒温主要是作为提高重现性考量的。毛细管区带电泳毛细管内壁改性
CZE对于小分子和大分子来说都是一项重要的分离技术,但是溶质与毛细管内壁的相互作用,尤其是蛋白质在毛细管内壁的吸附,使分离效率大为降低。内壁对蛋白质吸附作用机理
毛细管区带电泳毛细管内壁改性不直接对毛细管壁作任何改性,采用极端的pH可以有效地降低离子性相互作用,但其局限性在于在非生物性的pH下,可能使蛋白质的结构发生改变。采用高离子强度缓冲溶液能够限制离子性相互作用,但是会产生大量的焦耳热。使用小孔毛细管能够降低热效应,但是高的比表面会加重蛋白质——管壁间的相互作用。毛细管区带电泳毛细管内壁改性
进行毛细管内壁改性是限制溶质吸附的一种选择方案,有两种基本的方法:
(a)通过共价键合或物理粘合进行永久性改性;
(b)使用操作缓冲溶液进行动力学去活。两种方法各有其成功之处,但没有哪一种方法占明显优劣。
毛细管区带电泳形成键合相或粘合相
先进行硅烷化再用合适的官能团去活是应用最广的方法。可以利用不同的物质去活,如聚丙烯酰胺、五氟代芳基或多糖类。但是硅氧键(Si-O-Si)只有在pH4-7的范围内才是稳定的,而且使用时会发生水解,限制了它的长期稳定性。
化学键合物理吸附毛细管区带电泳形成键合相或粘合相
共价改性剂是很稳定的,不需要特殊保存。由于毛细管用后通常需要清洗(即使涂壁以后仍不能完全消除吸附),它们必须对清洗溶液稳定而且耐冲洗。遗憾的是,大多数涂层的稳定性是有限的。毛细管区带电泳动力学去活
除了与管壁形成键合相或粘合相以外,把改性剂直接加到操作缓冲溶液中是毛细管壁改性的另一种方法。动力学涂壁的优点是其动力学稳定性,因为改性剂存在于缓冲溶液中,管壁表面的改性剂被连续更新,不要求其热力学稳定。与共价涂层一样,添加剂能够与毛细管壁作用而改变其电荷和疏水性,这一类改性剂很容易补充和更换,因为只需把它们溶解于缓冲溶液中即可。但是重现比较差。胶束电动色谱
原理:是电泳技术与色谱技术的交叉,它由Terabe于1984年提出,在操作缓冲液中加入表面活性剂(如8~9mMSDS),形成疏水内核、外部带负电的胶束相,根据分子在胶束相-溶液两相中的分配系数不同进行分离测定,还可以通过形成手性的复合胶束用于手性对映体的拆分。应用:是目前唯一既能分离中性又能分离带电组分的HPCE模式。表面活性剂的种类按极性基团的解离性质分类1、阴离子表面活性剂:硬脂酸,十二烷基苯磺酸钠
2、阳离子表面活性剂:季铵化物3、两性离子表面活性剂:卵磷脂,氨基酸型,甜菜碱型4、非离子表面活性剂:脂肪酸甘油酯,脂肪酸山梨坦(司盘),聚山梨酯(吐温)根据亲水基进行分类,分为羧酸盐、硫酸盐、季铵盐、PEO衍生物、内酯等胶束电动色谱用MEKC分离中性组分需要在操作缓冲溶液中加入表面活性剂,在临界胶束浓度(例如对SDS为8—9mM)以上,单个的表面活性剂分子之间聚集而形成胶束。胶束是一个团状结构,表面活性剂分子疏水性的一端聚在一起朝向里从而避开了亲水性的缓冲溶液,带电荷的一端则朝向缓冲溶液。分离机理是基于胶束与中性分子之间的相互作用。
胶束电动色谱表面活性剂分子和胶束通常是带电的,它们沿与EOF相同或相反的方向迁移(取决于其所带的电荷)。阴离子表面活性剂,如SDS向阳极迁移,与EOF的方向相反。由于在中性和碱性pH下,EOF的移动通常比胶束的迁移速率快,胶束的实际移动方向是与EOF一致的。胶束在移动过程中,与色谱行为相似,能够与溶质发生疏水性和静电相互作用。
胶束电动色谱
对于中性组分来说,分离仅受溶质进入和离开胶束这一行为的影响。由于胶束迁移方向与EOF相反,溶质与胶束间作用力越强,迁移时间越长,当溶质不与胶束作用时,仅随EOF一起移动。溶质的疏水性越强,与胶束间的作用力越强,“保留”时间也就越长。中性溶质在MEKC中的分离机理与色谱分离类似,可以用修改后的色谱关系式来描述。
胶束电动色谱
在MEKC中很容易控制选择性,使用不同的表面活性剂以形成具有不同物理性质(如大小、电荷、几何形状)的胶束就能使选择性发生显著变化,就象在LC中改变固定相一样。表面活性剂可以是阳离子型的、阴离子型的、非离子型的、两性离子型的或者是几种类型的混合使用。
在各种情况下都可以通过改变缓冲溶液浓度、pH、温度及使用添加剂,如尿素、金属离子或手性选择剂等方法来改变MEKC的选择性。胶束电动色谱与色谱分离一样,在MEKC中也可以加入用来控制溶质——胶束之间的相互作用的有机修饰剂。已经成功应用的有机修饰剂有甲醇、乙腈、异丙醇等。有机溶剂的用量一般在占操作缓冲溶液的50%(V/V)以下。有机溶剂的加入将削弱溶质与胶束间的疏水相互作用,同时也将削弱维持胶束结构的表面活性剂分子间的疏水分子相互作用,加快色谱动力学。毛细管凝胶电泳
在毛细管中装入单体,引发聚合形成凝胶的CE模式,主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。它是基于分子尺寸,让溶质在合适的起“分子筛”作用的聚合物内进行电泳而分离。当带电溶质在电场力的推动下在聚合物的网状结构内迁移时,其运动要受到一定程度的阻碍,大分子受到的阻碍比小分子大。大分子物质,如DNA和被SDS饱和的蛋白质,由于其质荷比与分子大小无关,没有凝胶存在不可能实现分离。以DNA为例,DNA链每增加一个核苷酸,就增加一个相同的质量和电荷单位,对它在自由溶液中的淌度没有影响。毛细管凝胶电泳原理:是一种将凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。由于溶质分子体积不同,在起分子筛作用的聚合物内进行电泳时被分离。应用:适用于生物大分子的分析,如蛋白质、寡聚核苷酸、DNA、RNA,还可用于PCR产物分析。毛细管凝胶电泳CE比传统的板式凝胶电泳优点在于:可以施加比板式电泳高10—100倍的场强而不会引起对分离不利的焦耳热效应。毛细管柱上检测和仪器的自动化操作。而且,由于毛细管本身已经具有抗对流的作用,不必再使用具有抗对流性质的凝胶。
缺点是制备功能远远不及板式电泳,当然,现在使用大孔径毛细管(内径>100—200μm)和低场强,在HPCE中也能实现一定程度的制备型分离。毛细管凝胶电泳在传统的板式或管式电泳中常用交联的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,前者网孔(或孔尺寸)较小,用于分离蛋白质,后者网孔大,适合于分离DNA。在板式或管式电泳中,这些介质不仅起尺寸分离的作用,而且能够抑制对流并保持自身形状不变。琼脂糖电泳使所用凝胶的最小浓度和组成有一定的限制,但是由于小孔毛细管具有抗对流的作用,这一限制在CGE中就放宽了。毛细管凝胶电泳CGE中所使用的“凝胶”这个词有些含混不清,因为一般凝胶是指在板式凝胶电泳中所形成的那种类似固体一样的结构,而CGE中所使用的“凝胶”并不(也不需要)具备这个特点,把它叫做“聚合物网”更为恰当。CGE中使用的聚合物可以是共价交联的(如双—聚丙烯酰胺)、氢键结合的(如琼脂糖)或是线状的聚合物溶液(如聚丙烯酰胺或甲基纤维素)。虽然非交联凝胶的聚合物结构与交联凝胶有着根本区别,但它们的分离机理是相同的,两种凝胶都能实现大分子尺寸分离。毛细管凝胶电泳交联聚丙烯酰胺是一种广泛应用的基体,它在使用时就地聚合,聚合后不能从毛细管内除去。制备这种凝胶时要特别小心,聚合反应过快,使用未经脱气的溶液,或者化学药品的不纯都会使聚合时出现空泡或形成不稳定的凝胶。交联聚丙烯酰胺的一个潜在缺点是它的刚性,使用时如果样品较脏,毛细管未端堵塞,或者出现空泡都使得毛细管不能再用。因此要格外小心,防止以上情况发生。如果使用正确,一根毛细管可以进样多次,但是由于凝胶的刚性,不能采用流体动力进样。毛细管凝胶电泳低粘度的聚合物溶液可以利用压力进样,管内凝胶可以重复更换(取决于其浓度和粘度),而且不易受空泡形成和其它因素的影响。当凝胶具备上述稳定性时,其粘度越低,对毛细管壁涂(如果使用的话)的依赖性越高。不论用哪种方式,通常都进行毛细管涂壁以降低EOF。
毛细管凝胶电泳
CGE的分离度和分离效率与CZE相当,因为它们都属于“区带”电泳技术。一个明显的差别在于CGE对DNA分离具有极高的效率。用交联聚丙烯酰胺分离单链寡聚核苷酸能达到超过107/米的塔板数。与CZE相似,CGE的选择性可以通过加入手性选择剂、离子对试剂或其它更复杂的试剂(如分析DNA加入ethidiumbromide,分析蛋白质加入SDS)来调节,这些试剂可以键合到凝胶上,也可以直接加到操作缓冲溶液中。毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦(CIEF)是一项依据pI进行多肽或蛋白质分离的“高分辨”电泳技术。CIEF能分离仅相差0.005甚至更低的pI单位的蛋白质。与CGE相似,这是一项把凝胶电泳应用到CE中的新技术。原理:用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使具有不同等电点(pI)的多肽或蛋白质在电场力的作用下迁移到等电点的位置,形成非常窄的聚焦区带。该方法能分离仅差0.005甚至更低pH单位的蛋白质。应用:已成功地用于测定蛋白质等电点、分离异构体或其它方法难以分离的蛋白质、多肽等。毛细管等电聚焦在CIEF中,首先要用两性电解质在毛细管内建立pH梯度。两性电解质是指那些同时具有酸性基团和碱性基团(两性离子),而且在CIEF实验所需要的pH范围内(如pH3—9)具有广泛pI值的物质。当把毛细管内充满溶质混合物和两性电解质后pH梯度很快形成。阴极放到碱溶液中,阳极放到酸溶液中,施加电场后,带电的两性离子和蛋白质在介质中开始迁移直到它们到达一个不带电的区域(在其pI处),这个过程称为“聚焦”。蛋白质在CIEF中能够保持在一个很窄的区带内,因为一旦它进入一个不同于其pI值的pH区域就会带上电荷,在电场力的作用下又会迁移回pH等于其pI处。毛细管等电聚焦聚焦过程可以利用电流来指示,一旦聚焦完成即达到稳态,电荷不再移动。聚焦完成后移动溶质和两性电解质使区带通过检测器,这种移动可以通过从毛细管一端施加压力或在一个电极槽中加入盐类来实现。毛细管等电聚焦在CIEF中需要降低或消除EOF,因为EOF会使得两性电解质在溶质聚焦完成之前就流出毛细管。可以使用动力学涂
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