尼帕病毒专题知识讲座培训课件

一.病毒因子

1.微生物分类和实验室及实验室活动分级

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）属于属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、亨尼帕（Henipavirus）病毒属中的一员。该属为新近分类的病毒属，包括NiV和亨德拉病毒（HendraVirus）２个病毒成员。根据卫生部《人间传播的病原微生物名录》的危害程度分类，NiV属于第一类病原微生物，涉及病毒培养、未经培养的感染材料以及动物实验均要在（A）BSL-4实验室进行。1尼帕病毒专题知识讲座8/23/20242.流行情况1998年9月至1999年4月马来西亚爆发NiV疫情，257人感染，105人死亡，死亡率为40.8%；116万多头猪被扑杀。2001年，印度亦发生NiV传染，死亡率为75%。2001~2011年孟加拉国先后暴发8次NiV疫情，平均死亡率为63.6%。泰国和柬埔寨均从果蝠中检测到NiV。2009年，中国中科院武汉病毒所石正丽研究员领导的研究组首次发现中国大陆蝙蝠体内存在NiV或尼帕样病毒抗体，提示我国存在尼帕或类似病毒的自然疫源地。2尼帕病毒专题知识讲座8/23/20243尼帕病毒专题知识讲座8/23/20243.病毒基因组结构及分类NiV基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组大小为18252bp或18246bp，目前已获得NiV全长基因序列。NiV有6个转录单位，分别编码6个主要结构蛋白——核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、脂蛋白或吸附蛋白（G）、大蛋白（L）或RNA多聚酶。4尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024目前，NiV还没有统一的分型方法，Chang等通过Genbank所有分离病毒株的N、M、P、F、G和L基因开放阅读框进行序列对比和遗传进化分析发现，NiV有三个进化分支，分别是马来西亚经典毒株，柬埔寨分离株，孟加拉分离株。马来西亚流行的NiV和孟加拉流行的NiV基因组差异较大（同源性为91.8%）。从柬埔寨果蝠中检测到的NiV与马来西亚NiV毒株相似。从泰国果蝠中检测到NiVRNA有一份与马来西亚NiV毒株的RNA序列类似，另外7份与孟加拉NiV毒株的RNA序列类似。经对印度分离的NiV基因序列分析表明，与孟加拉分离株的同源性在核酸水平为99.2%，氨基酸水平为99.8%，显示了病毒的同源性。5尼帕病毒专题知识讲座8/23/20246尼帕病毒专题知识讲座8/23/20244.病原因子的理化特性通过负染技术可知,NiV呈多形性或圆形,由囊膜和核衣壳组成,大小为200-300nm,在细胞膜上完成发育过程,核衣壳结构呈螺旋形,核衣壳直径13.0-18.0nm,螺距5.5-7.0nm,外由具有纤突

的囊膜所包被。NiV在体外不稳定,对热和消毒剂较敏感,NiV在体外不稳定，对热敏感，56℃30min即可使其灭活。NiV与其它副粘病毒相同，一般的消毒剂诸如0.5%次氯酸钠、0.5%酚或75%乙醇以及肥皂等清洁剂很容易将其灭活。7尼帕病毒专题知识讲座8/23/20245.病毒的培养特性NiV在很多哺乳动物细胞多能生长，如在Vero、BHK细胞中生长良好，但在昆虫细胞中不能生长。在培养细胞中产生明显的CPE（cytopathiceffect，致细胞病变效应）。表现为多个细胞融合成多核巨细胞形成特征性合胞体，在细胞浆中形成包涵体。将临床标本接种细胞后5-7天就能观察到病变，如果用高效价病毒接种Vero细胞，24小时后即可看到明显病变。8尼帕病毒专题知识讲座8/23/20246.宿主范围NiV可以感染多种动物，如猫、狗、马、山羊等，但猪是该病毒的主要传染源，而果蝠是该病毒的自然宿主，在其尿样和咬过的水果中，均能分离到到NiV9尼帕病毒专题知识讲座8/23/20247.传播途径NiV感染患者的唾液、气管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分离到病毒。果蝠的尿液与吃剩下的水果中带有NiV。其流产胎儿和其它分娩产物也可能含有NiV。猪的呼吸道分泌物带有NiV，也未排除尿液中带有病毒的可能性。已证实其它动物的感染主要是与感染猪的接触。2001–2008年孟加拉和印度爆发疫情原因可能是：1饮食用了被感染果蝠的尿液或唾液污染了的水果或水果产品（如未加工的椰枣汁）。2密切接触或暴露于感染病人的分泌物或排泄物（如唾液、尿液、呕吐物或排泄物）导致的NiV直接由人传染给人。用仓鼠进行的气溶胶传播实验表明[1]，NiV通过气溶胶传播的可能性较低（EDWit，etal，NipahVirusTransmissioninaHamsterModel.PlosNeglectedTropicalDiseases,

2011,

5(12):e1432）10尼帕病毒专题知识讲座8/23/20248.传播速度NiV在感染猪场之间传播很快，同一猪场内传播可能是直接通过身体接触，也可能是健康猪直接接触病猪的尿、唾液、气管分泌物等而引起。也可通过垂直传播，此外也可能是通过使用人工授精等方式传播。11尼帕病毒专题知识讲座8/23/20249.实验动物感染剂量金黄地鼠经鼻腔内接种NiV6×105PFU(plaqueformingunit，噬菌斑形成单位)，接种后9-21天发病死亡；

非洲绿猴经气管内接种NiV2.5×103PFU，接种后12天即可导致动物死亡；

雪貂经口鼻途径接种NiV500、5,000、50,000TCID50(Tissuecultureinfectivedose，50%组织细胞感染量)，可导致雪貂发热、食欲不振、重度消沉、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难，个别雪貂见有中枢神经障碍症状；

猪：经口鼻途径实验感染（2.5×105PFU）猪可引起轻度临床症状，如体温升高和轻度呼吸症状（呼吸频率增加和轻度咳嗽），但经口腔和皮下接种感染（5×104TCID50）可导致严重的神经症状。

12尼帕病毒专题知识讲座8/23/202410.临床及病理变化NiV感染人：NiV可引起人类脑炎，进展快，病死率高。潜伏期为4-60d，90%的病例少于2周。主要临床症状为体温升高、头痛、头晕和呕吐。50%以上的病例有意识减退和显著的脑干功能障碍。其它症状还有节段性肌痉挛、反射消失、肌张力减退、高血压、心动过速等。除中枢神经系统症状外，有一些病例有呼吸道症状，如呼吸困难、咳痰，胸部听诊双侧肺部有啰音。严重的病人可发生并发症，包括败血症、胃肠道出血、肾功能损害等。

13尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024直接的死因主要是脑炎，特别是累及到脑干。存活者中，75%可完全康复，其余25%有残存的神经系统损害。在急性期有正常意识的病人中，经过大约2周的平均病程后，均可完全康复，而在急性期有意识减低的病人中，仅15%可完全康复。此外，急性期病人的唾液、气管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分离到病毒。人感染NiV后病变最严重的器官是脑，其他器官（如肺、心脏和肾等）也可出现充血等相应病变，组织学检查可见血管炎，小动脉、静脉与毛细血管内皮损伤，血管壁坏死、出血和血栓形成等。脑、肺和肾的血管内皮有大的融合细胞形成。出现血管炎的血管周围有微小坏死和缺血灶。免疫组化法检测脑血管内皮细胞、周围神经原细胞和支气管上皮细胞，可检NiV抗原。14尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024NiV感染猪：猪病死率低，为5-15%，感染率高达100%，潜伏期为7-14d。猪的尼帕病毒感染可出现中枢神经系统和呼吸系统症状，但临床特征随猪的年龄不同而异。小于６个月的猪出现急性体温升高、呼吸困难、咳嗽、发抖、肌肉抽搐、后肢痉挛性或无力性麻痹、步态不协调等。成年猪可出现体温升高、呼吸困难、唾液分泌增多、流涕、易激怒、头部颤动、口紧闭、眼球震颤、抽搐，甚至突然死亡，母猪可能早产。

15尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024猪感染NiV后肺部可出现不同程度的病变、出血；气管和支气管充满泡沫样、有时血水样液体；脑部充血、水肿；肾也有类似病变。猪的组织病理学变化与人类似，用免疫组化法检测，在感染的血管内皮细胞和肺支气管上皮细胞，也可检出高浓度的尼帕病毒抗原。临床诊断时，NiV需要与能够引起猪急性死亡或呼吸道、神经症状的疾病加以鉴别。16尼帕病毒专题知识讲座8/23/202411.预防与治疗措施(1)特异性受体近年来,研究人员发现ephrinB2配体为尼帕病毒的特异性受体。这一发现将有助于进一步阐明其发病机制,并为促进有效药物的研发奠定基础。(2)疫苗研制目前处于研究阶段的NiV病疫苗包括DNA疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗以及病毒样粒子疫苗等，虽然在实验研究过程中呈现了一定保护效果，但均未进入临床应用阶段。17尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024(3)治疗先前的临床试验表明，抗病毒药Ribavirin(利巴韦林)可减少发热时间，缓解症状，降低急性脑炎死亡率，其衍生物EICAR、6-氮尿苷(6-aza-uridine)、吡唑呋喃菌素(pyrazo-furin)在体外试验中对NiV显示出很强的抑制作用；干扰素诱生剂poly(I)-poly(C12U)在动物模型中具有抵抗NiV致死性攻击的作用。(GEORGES-COURBOTMC,CONTAMINH,FAUREC,etal.Poly(I)-poly(C12U)butnotribavirinpreventsdeathinahamstermodelofNipahvirusinfection[J].AntimicrobAgentsChemother,2006,50:1768-1772.

BOSSARTKN,BRODERCC.DevelopmentstowardseffectivetreatmentsforNipahandHendravirusinfection[J].ExpertRevAntiInfectTher,2006,4:43-55.)18尼帕病毒专题知识讲座8/23/20241病原学检测

1.1NiV分离鉴定NiV能够在多种培养细胞中生长并快速增殖至较高的滴度。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和兔肾细胞RK-13细胞系对NiV尤为敏感。通常在病毒感染3d内能够观察到病毒病变效应(CPE)，但一般来说在细胞上传代2次，每次5d所达到的分离效果更为稳定。经低毒量稳定传代后的病毒再次感染细胞后24-48h，细胞出现以形成合胞体为特征的CPE，并且感染早期，合胞体中所有细胞核位于合胞体中央，而晚期则被运送至合胞体外，并聚集在其周围[1]。(HYATTAD，ZAKISR，GOLDSMITHCS，etal.UltrastructureofHendravirusandNipahviruswithinculturedcellsandhostanimals[J].MicrobesInfect，2001，3：297-306)

二.实验室诊断技术

19尼帕病毒专题知识讲座8/23/20241.2分子诊断技术NiV的基因组全序列已被测出，研究者们可以在此基础上针对NiV的分子诊断技术进行相应的研发。目前，已经被报道的针对NiV的分子检测技术有两种，分别为荧光定量RT-PCR和双重套式RT-PCR。

20尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024(1)荧光定量RT-PCR：该方法敏感度高、特异性强，并且不需要接触活的感染性病毒，具有生物安全性的优势。其检测灵敏度可以达到１PFU[2]

（GUILLAUMEV，LEFEUVREA，FAUREC，etal.SpecificdetectionofNipahvirususingreal-timeRT-PCR(Taqman)[J].JVirolMethods，2004，120:229-237.）并且有被学术界普遍认可的相关引物和探针：Primer1：5’—TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA—3’；Primer2：5’—CCCCTTCATCGATATCTTGATCA—3’；Taqmanprobe：5’—6FAM—CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGT—AMRA—3’为NiV的实验室快速诊断提供了技术支持[3]。(MUNGALLBA，MIDDLETOND，CRAMERIG，etal.Felinemodelofacutenipahvirusinfectionandprotectionwithasolubleglycoprotein-basedsubunitvaccine[J].Jvirol，2006，80，12293-12302)21尼帕病毒专题知识讲座8/23/2024(2)双重套式RT-PCR：Wacharapluesadee等描述了一种带有内参的双重套式RT-PCR检测技术。该技术能够用于对果蝠尿样的检测，并且加入内参大大降低PCR相关的抑制因素带来的假阴性的结果，提高检出准确率，在NiV流行病学调查时大大提高NiV监测数据的可靠性[4]。(WACHARAPLUESADEES，HEMACHUDHAT.DuplexnestedRT-PCRfordetectionofNipahvirusRNAfromurine