重组DNA技术的基本工具课件【知识精讲精研】高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

选择性必修3生物技术与工程——第3章基因工程2019-2020年普通高等学校招生全国统一考试大纲(生物)现代生物科技专题知识内容要求6-1基因工程

(1)基因工程的诞生(2)基因工程的原理及技术(含PCR技术)(3)基因工程的应用(4)蛋白质工程ⅠⅡⅡⅠ6-2克隆技术

(1)植物的组织培养(2)动物细胞培养与体细胞克隆(3)细胞融合与单克隆抗体ⅡⅡⅡ6-3胚胎工程

(1)动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础(2)胚胎干细胞的移植(3)胚胎工程的应用ⅠⅠⅡ2019-2020年普通高等学校招生全国统一考试大纲(生物)现代生物科技专题知识内容要求6-4生物技术的安全性和伦理问题

(1)转基因生物的安全性(2)生物武器对人类的威胁(3)生物技术中的伦理问题ⅠⅠⅠ6-5生态工程

(1)简述生态工程的原理(2)生态工程的实例ⅡⅠ实验要求7-1基因工程(1)DNA的粗提取与鉴定实验与探究能力Ⅰ.对所列知识点要知道其含义，能够在试题所给予的相对简单的情境中识别和使用它们。Ⅱ.理解所列知识和其他相关知识之间的联系和区别，并能在较复杂的情境中综合运用其进行分析、判断、推理和评价。考纲要求历年年考情(1)基因工程的诞生(l)[2017全国Ⅰ，T38(5)](2)基因工程的原理及技术(含PCR技术)(ll)[2017全国Ⅰ，T38(1)(2)(3)(4)][2017全国Ⅲ，T38(1)(2)](2016全国Ⅰ，T40)(2014全国Ⅱ，T40)[2013全国Ⅰ，T40(1)](3)基因工程的应用(ll)(2017全国Ⅱ，T38)(2015全国Ⅰ，T40)(4)蛋白质工程(l)(2015全国Ⅱ，T40)[2013全国Ⅰ，T40(2)]选修三

2014-2020年全国卷考察内容一览2019全国Ⅰ卷细胞工程2019全国Ⅱ卷生态工程2019全国Ⅲ卷基因工程、胚胎工程2019全国Ⅰ卷基因工程、PCR技术2019全国Ⅱ卷植物组织培养技术2019全国Ⅲ卷植物组织培养技术2018全国Ⅰ卷基因工程2018全国Ⅱ卷基因工程、PCR技术2018全国Ⅲ卷胚胎工程、细胞工程-核移植2017新课标Ⅰ卷基因工程、基因组文库2017新课标Ⅱ卷基因工程、cDNA文库2017新课标Ⅲ卷基因工程、PCR技术、细胞工程-细胞培养2016新课标Ⅰ卷基因工程2016新课标Ⅱ卷细胞工程-核移植2016新课标Ⅲ卷基因工程2015新课标Ⅰ卷基因工程-逆转录cDNA文库2015新课标Ⅱ卷蛋白质工程2014新课标Ⅰ卷细胞工程-动物细胞融合-单克隆抗体制备2014新课标Ⅱ卷基因工程-基因文库我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢?基因工程是如何进行操作的?它给我们的生产和生活带来了怎样的影响?基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，使棉花大量减产，严重时甚至绝收。大量施用农药杀虫不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，就能解决这一问题。

棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。抗虫棉棉花细胞

普通棉花

(无抗虫特征)(含抗虫基因)

棉花植株(有抗虫特征)基因工程抗虫基因提取苏云金芽孢杆菌(有抗虫特征)基因工程主要内容基因工程概念科技探索之路——基因工程的诞生和发展重组DNA技术的基本工具探究●实践DNA的粗体与鉴定基因工程的基本操作程序探究●实践DNA片段的扩增即电泳鉴定拓展视野历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献基因工程的应用蛋白质工程的原理和应用发展素养通过本章的学习，应在以下两个方面得到发展。能够基于基因工程应用的事实，运用基因工程的原理参与有关推广和应用基因工程产品等社会行为的讨论，理性地作出个人决策。认同基因工程给现代农牧业、食品及医药等行业带来了深刻的变化，产生了巨大的社会效益和经济效益。基因工程主要内容基因工程概念科技探索之路——基因工程的诞生和发展重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车探究●实践DNA的粗体与鉴定学习目标科学思维：结合具体的应用实例，说明基因工程技术的原理、工具和操作过程。科学思维和社会责任：通过对比分析蛋白质工程和传统基因工程的不同及应用价值。科学思维和科学探究：通过实际操作学会细胞中DNA的提取和鉴定方法，学习PCR技术原理和操作一、基因工程的概念1.基因工程的概念

是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。别名重组DNA技术、转基因技术原理基因重组(广义)操作水平DNA分子水平操作环境主要在生物体外操作对象基因(DNA)基本过程剪切→拼接→导入→表达结果/目的获得人类需要的基因产物或定向改造生物性状优点：与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍

（打破生殖隔离，实现跨物种间的基因交流）与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状（可遗传的定向变异）另：蛋白质工程也可定向改造蛋白质基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。减数分裂I前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；减数分裂I后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。2.科技探索之路——基因工程的诞生和发展一、基因工程的概念3.基因工程的理论基础——拓展拼接的基础1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的传递都遵循中心法则基因在空间上转移并成功表达3.生物界共用一套遗传密码。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）DNA（基因）

转录翻译mRNA蛋白质番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”限制性内切核酸酶（限制酶）DNA连接酶基因进入受体细胞的载体（如质粒）科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识別双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3'端的羟基与另ー个DNA片段5'端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？工具分子运输车工具酶分子手术刀分子缝合针限制性内切核酸酶：准确切割DNA分子DNA连接酶：将DNA片段连接起来【易错警示】工具酶≠工具载体：将体外重组好的DNA分子导入受体细胞基因进入受体细胞的载体（如质粒）二、重组DNA技术的基本工具1.

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。(1)分布(来源)：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)化学本质：蛋白质(3)种类：从近多种微生物中分离出了约数千种限制酶。(限制酶不是一种酶，而是一类酶)(4)作用特性：能够识别双链DNA分子中特定的(脱氧)核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位（两个核苷酸之间）的磷酸二酯键断开。(切割具有专一性)磷酸二酯键例如：限制酶EcoRⅠ5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’特定的核苷酸序列特定部位（两个核苷酸之间）的磷酸二酯键切点中轴线二、重组DNA技术的基本工具1.

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。(5)限制酶的识别序列：一般为4-8个碱基，多为6个。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。思考·讨论：想一想限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列(一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致)。二、重组DNA技术的基本工具1.

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。(6)限制酶的作用结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式一一黏性末端和平末端。当限制酶识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ

限制酶能特异性识别__________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。EcoRI限制酶GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端SmaI限制酶Sma

I限制酶只能识别

序列，切割

和

之间的

切开，切割后产生

。CCCGGGCG磷酸二酯键平末端NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，多数限制酶的识别序列为回文结构二、重组DNA技术的基本工具1.

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。(7)命名规则：

限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:

E：Escherichia

（属名）

co：coli

（种加词）

R：RY13（品系）

I：首先发现在此类细菌中发现的顺序属名+种名+品系+此菌中发现顺序。如：EcoRⅠ=E+co+R+ⅠEcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢNaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，多数限制酶的识别序列为回文结构二、重组DNA技术的基本工具1.

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？思考·讨论：

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全5’-GAATTC………………Bt基因序列………………GAATTC-3’3’-CTTAAG………………Bt基因序列………………CTTAAG-5’探究‧活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。5’-GAATTC………………Bt基因序列………………GAATTC-3’3’-CTTAAG………………Bt基因序列………………CTTAAG-5’目的基因(Bt基因)识别序列识别序列5’-GAATTC………………Bt基因序列………………GAATTC-3’3’-CTTAAG………………Bt基因序列………………CTTAAG-5’目的基因黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端5’-3’-3’-5’-(3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？提示

不能。课堂练习(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？提示

断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。2.请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。三课堂练习识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。同尾酶3.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？提示

如图同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶产生的黏性末端一般不同，但有些可能会形成相同的黏性末端（同尾酶）。二、重组DNA技术的基本工具2.

DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

(2)分类：种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能特性只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率低。相同点恢复磷酸二酯键E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来Ecoli

DNA连接酶或T4DNA连接酶T4DNA连接酶(可用于连接末端，但连接效率低，但效率较低)注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的缺口，但不能连接单链DNA！

限制酶酶切DNA连接酶连接

旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？解旋酶DNA聚合酶DNA聚合酶游离的脱氧核苷酸5´5´3´3´新合成的子链

旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质 不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键二、重组DNA技术的基本工具2.

DNA连接酶——“分子缝合针”几种相关酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端课堂练习1.根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键2.(2022·天津耀华中学高二期中)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.②片段是在识别序列为

的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键D二、重组DNA技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)作用：作为运载工具，将外源基因导入受体细胞中，并能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制。(2)载体的必要条件①能在宿主细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。③常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。④对受体细胞无害，容易分离。(3)载体的种类：质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别二、重组DNA技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(4)常用载体——质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。质粒主要存在于细菌、放线菌和酵母菌等生物体内。有(多个)切割位点能复制，并带着插入的目的基因一起复制有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别，便于重组DNA分子的筛选二、重组DNA技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(4)常用载体——质粒标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）导入受体细胞培养加入氨苄青霉素只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖如何提高筛选的准确性

当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。氨苄青霉素抗性基因ampR四环素抗性基因tetR导入受体细胞培养质粒目的基因重组质粒氨苄青霉素抗性基因ampR目的基因加入氨苄青霉素含有氨苄青霉素抗性基因并且表达的大肠杆菌才能存活并增殖加入四环素(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素的载体时，如果插入某种抗生素基因内部，则会导致该抗生素基因失活。如图，目的基因插入了四环素基因内部，则四环素基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒—质粒的细菌。(3)筛选方法：将含有重组质粒的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。含有四环素抗性基因并且表达的大肠杆菌才能存活并增殖二、重组DNA技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(5)λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理这些基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是利用病毒对宿主细胞的侵染性。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。例：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是

。霍乱弧菌中含有质粒，但

（填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该

。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕不能对受体细胞无害重组DNA分子请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI

的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。重组DNA分子

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI

的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重组DNA分子1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。

不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重组DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG4.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割____次此DNA分子，产生____个黏性末端。5.目的片段翻转过来，可以连接吗？______6.目的片段可以自身环化吗？_______7.切割目的基因和载体时，需要用______限制酶，目的是____________________24可以可以同种产生相同的黏性末端*必须是同一种限制酶吗？不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。知识巩固下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。规律——选择酶切位点的原则：BamHI

和

HindIII①

防止目的基因的自身环化不能用EcoRI的原因②

防止目的基因反向连接到载体图1图2目的基因自身环化与目的基因反向连接到载体AATTCGGCTTAA目的基因自身环化目的基因和载体的随机连接目的基因正向连接到载体目的基因反向连接到载体5’-GAATTC………………Bt基因序列1………………GAATTC-3’3’-CTTAAG………………Bt基因序列2………………CTTAAG-5’5’-GAATTC………………Bt基因序列1………………GAATTC-3’3’-CTTAAG………………Bt基因序列2………………CTTAAG-5’目的基因自身环化与目的基因反向连接到载体的解决方法选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割-G-CTTAA-A-TCTAG-A-TCTAG-G-CTTAA知识巩固规律——选择酶切位点的原则

图甲

图乙根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接知识巩固规律——选择酶切位点的原则

(3)选择限制酶切割位点的基本原则：

①切割目的基因时：

。

②切割质粒时：

。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选限制酶作用部位：种类E.coliDNA连接酶运载工具条件③

有一个至多个限制酶切割位点质粒、噬菌体、动植物病毒DNA连接酶课堂小结作用部位：切开DNA分子的磷酸二酯键来源：主要存在于原核生物中特点：具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA连接酶①

对受体细胞无害②

能自我复制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的标记基因种类：磷酸二酯键作用结果：产生黏性末端或平末端基因工程的基本工具①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】②判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割拓展——能力提升③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列不同】也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链（同尾酶）故：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割④不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接总结：两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别课堂练习5.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是A插入点细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A.①是c；②是b；③是a

B.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是a

D.①是c；②是a；③是b课堂练习6.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因质粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。目的基因与目的基因质粒片段与质粒片段反向连接实验：DNA的粗提取与鉴定实验原理1.提取DNA的原理DNA的粗提取与鉴定(1)提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。(3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。(在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低)2.鉴定DNA的原理在一定温度下，DNA遇二苯胶试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。0DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L实验：DNA的粗提取与鉴定材料用具1.选材：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）DNA的粗提取与鉴定目的要求1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胶试剂对DNA进行鉴定。染色体数目多，细胞分裂旺盛，DNA含量较高。问题1:能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为其红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。实验：DNA的粗提取与鉴定材料用具DNA的粗提取与鉴定2.试剂：①研磨液3.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。SDS（十二烷基磺酸钠）：EDTA（乙二胺四乙酸）：使DNA保持稳定状态。能有效的破坏细胞膜的磷脂和膜蛋白。是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;Tris-HCl的缓冲体系（PH=8.0）：NaCl：DNA与蛋白质分离。②体积分数为95%的酒精析出DNA③2mol/L的NaCl溶液溶解DNA④二苯胺试剂鉴定DNA，要现配现用实验：DNA的粗提取与鉴定方法步骤DNA的粗提取与鉴定1.ＤＮＡ的提取①破碎细胞：称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨；研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量上清液可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。②去除杂质：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可以增加DNA分子的柔韧度，减少断裂，能降低DNA水解酶的活性，利于提取DNA。ａ、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；ｂ、低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。ｃ、抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出实验：DNA的粗提取与鉴定方法步骤DNA的粗提取与鉴定1.ＤＮＡ的提取③DNA的析出：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。避免破坏DNA动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。搅拌时动作要轻缓的原因玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面实验：DNA的粗提取与鉴定方法步骤DNA的粗提取与鉴定2.ＤＮＡ的鉴定④溶解ＤＮＡ：取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。⑤鉴定ＤＮＡ：向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。空白对照组

在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。实验：DNA的粗提取与鉴定方法步骤DNA的粗提取与鉴定2.ＤＮＡ的鉴定实验组对照组加入2mol/L氯化钠溶液加入2mol/L氯化钠溶液水浴加热不加入丝状物加入丝状物加入4mL二苯胺试剂加入4mL二苯胺试剂空白对照组实验：DNA的粗提取与鉴定结果分析与评价DNA的粗提取与鉴定试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaC1溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象溶液不变蓝色实验结论加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺试剂溶液逐渐变蓝DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色【请同学们补充完整以下实验步骤】实验：DNA的粗提取与鉴定结果分析与评价DNA的粗提取与鉴定思考·讨论：1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。评价结果——看提取物颜色——看与二苯胺反应颜色的深浅DNA纯度

DNA的量2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。实验：DNA的粗提取与鉴定结果分析与评价DNA的粗提取与鉴定思考·讨论：3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最