重组DNA技术的基本工具课件 【知识精讲精研】 高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

杨贵平选择性必修三第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）从社会中来一、基因工程的概述1.基因工程的概念：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。重组DNA技术生物体外基因DNA分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品基因重组定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍科技探索之路2.基因工程的诞辰和发展：3.图解“基因工程实质”转移A生物B生物萤火虫普通动植物发光基因一、基因工程的概述4.基因工程的理论基础拼接的基础1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码基因在空间上转移并成功表达接剪运一、基因工程的概述“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”二、限制酶——“分子手术刀”1.来源：主要是从原核生物中分离纯化（限制酶不是一种酶，而是一类酶）识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。2.作用:5'3'5'3'TAGGTATCCA1’2’3’4’5’

A1’2’3’4’5’G磷酸二酯键你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完整的防御机制。限制酶就是它的一种防御工具。当外源DNA入侵时，它就会利用限制酶来切割外源DNA,使之失效以保证自身的安全。二、限制酶——“分子手术刀”当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端;当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。3.结果:产生黏性末端或平末端。4.限制酶的识别序列的特点(1)大多数限制酶的识别序列均为6个核苷酸组成，如EcoRI、SmaI限制酶(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成(3)实例EcoRI(在G与A之间切割)识别序列：GAATTCSmaI(在G与C之间切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'识别序列：CCCGGG黏性末端平末端识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。思考·讨论同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。1.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？提示：

二、限制酶——“分子手术刀”2.请判断：以下黏性末端是由几种限制酶作用产生的。3三、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:将两个双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。2.种类:磷酸二酯键(形成)3.作用部位:注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！核心归纳1.比较DNA连接酶和DNA聚合酶（P72旁栏思考）三、DNA连接酶——“分子缝合针”2.与核酸相关的几种酶的比较三、DNA连接酶——“分子缝合针”基因工程用酶DNA复制用酶存在于病毒中核心归纳1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等2．常用载体——质粒(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。(2)作用①作为运输工具，将外源基因导入细胞。②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。四、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”①能在受体细胞中自我复制并稳定保存②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因③具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选（3）运载体需具备的条件：

标记基因通常有:抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。④对受体细胞无毒害作用。思考·讨论重组DNA分子请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列:5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCCATAC-

3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGGTATG-5'请你找到两条片段上EcoRI限制酶的识别序列和切割位点。然后，用剪刀“切割”并用透明胶粘连重组形成新的DNA序列。讨论：1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？限制酶、DNA连接酶2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能。因为基因的长度一般在100个碱基对以上。探究·实践（一）、实验原理1．提取DNA的原理利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。2．鉴定DNA的原理在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。五、DNA的粗提取与鉴定DNA+二苯胺沸水浴蓝色亲子鉴定00.142NaCI浓度（mol/L）探究·实践五、DNA的粗提取与鉴定DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。（二）、材料用具1.选材：2.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用注意EDTA（乙二胺四乙酸）:是一种DNA酶抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DMA。SDS(十二烷基硫酸钠):可使蛋白质变性与DNA分离。Tris（三羟甲基氨基甲烷）：提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系呈稳定状态。可用家用洗洁精或质量分数为10%的洗衣粉水溶液替代。第一步第四步第三步研磨加酒精析出溶解与鉴定称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA将丝状物或沉淀物溶于试管中的NaCl溶液中。然后，向试管中各加入4mL的二苯胺试剂鉴定（注意做对照实验）第二步提取上清液研磨液过滤到烧杯中，置于4℃冰箱中，几分钟后，再取上清液（也可以通过离心处理后再取上清液）探究·实践五、DNA的粗提取与鉴定（三）、方法步骤探究·实践五、DNA的粗提取与鉴定（三）、方法步骤称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。去除滤液中的杂质1．取材、研磨:2．过滤：3.DNA的析出加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。探究·实践4.DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定结果AB5.结论：DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色鉴定DNAAB不进行任何处理加丝状物或沉淀加4mL二苯胺，混匀加4mL二苯胺，混匀沸水浴5min沸水浴5min溶液不变蓝色溶液逐渐变成蓝色DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色五、DNA的粗提取与鉴定（四）、结果分析与评价探究·实践五、DNA的粗提取与鉴定1.你提出白色丝状物或沉淀物了吗?用二苯胺试剂鉴定的结果如何?提示：观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的会质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功;如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗?提示：本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。提示：本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料;也可以在阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。《3年高考2年模拟》课堂练习1．限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示．下列有关说法错误的是（）A．a酶与b酶切断的化学键相同B．能被b酶识别并切割的序列也能被a切割C．在相同的DNA分子中a酶的识别位点一般明显要比b酶多D．将大量a酶和b酶切割后的片段混合，重新连接后的DNA片段不一定全都能被a切割D《3年高考2年模拟》2.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因质粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正