GB∕T 35959-2018 液相色谱-质谱联用分析方法通则

液相色谱-质谱联用分析方法通则中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局GB/Z35959—2018 I 2规范性引用文件 13术语和定义 4液相色谱-质谱联用分析方法提要 2 36仪器配置 37仪器安装环境要求、安全及注意事项 48分析步骤 59数据质量的保证 9I本指导性技术文件按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本指导性技术文件由中国石油和化学工业联合会提出。本指导性技术文件由全国化学标准化技术委员会(SAC/TC63)归口。本指导性技术文件起草单位：广东省茂名市质量计量监督检测所、中国检验检疫科学研究院、中国检验认证集团宁波有限公司、中国石油和化学工业联合会、中海油天津化工研究设计院有限公司、重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心、华南师范大学、中国石油化工股份有限公司北京北化院燕山分院、杭州市特种设备检测研究院。本指导性技术文件主要起草人：安晓春、马宏园、陈会明、王振新、杨建海、吴晓涛、王琪、宋乃宁、本指导性技术文件仅供参考。有关本指导性技术文件的建议和意见，请向国务院标准化行政主管部门反映。1液相色谱-质谱联用分析方法通则本指导性技术文件规定了使用液相色谱-质谱联用分析方法进行定性定量分析的通用规则。本指导性技术文件适用于使用液相色谱-质谱联用分析方法对化合物定性定量分析的一般要求。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6041质谱分析方法通则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T16631—2008高效液相色谱法通则GB/T6041和GB/T16631界定的以及下列术语和定义适用干本文件。液相色谱法liquidchromatography;LC用液体作为流动相的色谱法。质谱法massspectrometry试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。用作分离功能的液相色谱与具有定性定量功能的质谱实现在线相联的一种分析技术。m/x离子的质量m与其所带的电荷数x之比，以m/z表示。在一段连续的质量范围内对所有质量的离子进行检测。对多对母离子及其相应产生的子离子的过程进行监测。提取离子色谱图extractedionchromatogram;EIC在一张总离子流色谱图上挑选某一个质荷比离子，得到该离子的强度随时间变化关系图。2GB/Z35959—2018调谐tuning当质谱仪的高真空达到要求值并处于稳定状态后，检查质谱仪质量坐标的准确性，通过自动或手动调节仪器的各项参数，使仪器达到最佳状态。4液相色谱-质谱联用分析方法提要液相色谱-质谱联用仪主要由液相色谱、接口装置、质谱仪、数据处理系统组成。液相色谱能有效地将待测物的成分分离开，质谱仪能对分开的成分逐个检测，得到分子量、结构和浓度信息。联机的关键是适用接口的开发。常见的接口装置是大气压电离源(API),其包括电喷雾离子源(ESI)、大气压化学离子源(APCI)和大气压光电离子源(APPI)等。API的特点列于表1。表1大气压电离源(API)类型原理应用电喷雾离子源去除溶剂后的液滴电离成离子的过程适用于强极性化合物分析大气压化学离子源利用电晕放电使空气中某些中性分子电离，溶剂分子也被电离，这些离子与样品分子进行离子-分子反应，使样品分子离子化适用于中等极性化合物分析大气压光电离子源样品经加热和雾化，使溶剂和溶质气化，用一定波长的光与它们作用，实现气相离子反应适用于弱极性及至非极性化合物分析液相色谱-质谱联用法是利用试样各组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配和吸附系数不同，由流动相把试样带入色谱柱中进行分离后，经接口装置，由离子源离子化产生带有一定电荷、质量数的离子碎片，不同的离子碎片在不同的电场和(或)磁场的运动行为不同，质量分析器(见表2)把离子按质荷比分开，得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性、定量分析结果。液相色谱-质谱联用法将色谱的分离能力和质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。液相色谱-质谱联用法可应用于测定大分子量、极性、热不稳定和非挥发性的化合物。表2质量分析器类型原理特点扇形磁质量分析器样品在离子源内电离成离子，在加速电压的作用下，以一定的速度进入均匀的磁场，受到与离子运动方向和磁场方向垂直的力，沿着曲率半径为r的轨迹运动，离子经质量分析器，按质荷比分离并聚焦单聚焦磁质量分析器分辨率低，双聚焦磁质量分析器分辨率很高四极杆质量分析器在特定的四极场中，某一质荷比的离子能作稳定的振荡，通过四极场面被接收，其他质荷比的离子则被滤掉，在保持直流电压和射频电压振幅比值恒定而连续改变它们的值(扫描)时，不同质荷比的离子依次通过四极场，实现质量分离体积小，重量轻，操作方便，扫描速度快，灵敏度高3GB/Z35959—2018表2(续)类型原理特点析器用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器检测离子的质荷比范围非常宽；灵敏度高；扫描速度快离子阱质量分析器离子阱与四极质量分析器的原理类似，当高频电压幅值和高频电压频率固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器结构简单、价格便宜，性价比高；灵敏度高；质量范围大傅立叶变换离子回旋共振质量分析器将离子源产生的离子束引入ICR中，随后施加一个涵盖了所有离子回旋频率的宽频域射频信号。在此信号的激发下，所有的离子都开始进行回旋运动。回旋运动在ICR的接受板上感应出一个像电流，并且被精确地记录下来。在经过傅立叶频转换以后就可以获得一个完整的频率域谱具有高分辨率、高灵敏度、质量范围宽、扫描速度快、性能可靠；可以完成多级(时间上)串联质谱的操作5.1通用要求水、试剂和溶剂在分析前应经过有效过滤。5.2水本标准使用的水应满足GB/T6682中规定的一级水。5.3试剂试剂应是分析纯试剂或纯度更高的试剂。试剂不应干扰分析。溶剂应是色谱级的产品或质量相当或纯度更高的产品。它们不应干扰所使用的检测器性能。气体应是高纯的惰性气体，如氮气、氩气等，并符合有关标准规定。6仪器配置6.1进样系统进样系统应密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。自动进样是常用的进样方式。6.2液相色谱柱色谱柱是色谱系统的核心，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。从进样器到色谱4柱入口的流路和从色谱柱出口到质谱的流路应使用死体积尽可能小的管路。6.3离子源离子源是质谱仪最重要的部分，常用的是大气压电离源(API),包括电喷雾离子源(ESI)、大气压化学离子源(APCI)和大气压光电离子源(APPI)等。其中ESI最常用。6.4质量分析系统质量分析系统能将不同质荷比的离子进行分离。质量分析系统有几种不同的类型，包括扇形磁场、四极杆、离子阱、飞行时间以及傅立叶变换离子回旋共振等。6.5检测器检测器包括离子收集和信号放大与输出等。液相色谱-质谱联用仪能实现高灵敏度检测的关键在于检测器，检测器的增益、动态范围、响应时间、噪声值等是评价它的主要性能指标。6.6入口系统液相色谱-质谱联用仪的入口系统涉及液相色谱质谱联用的接口。6.7真空系统真空系统一般是由低真空的机械泵和高真空泵组合而成的真空机组。高真空泵可以是油扩散泵或者是分子涡轮泵，若是前者则需附上冷阱系统，以冷凝油蒸气。质谱仪需在真空条件下进行工作，产生的离子从质量分离到收集器检测的整个过程中不可与其他残留气体分子发生碰撞，否则会失去一部分能量使它的运动轨道发生偏离。6.8数据系统数据系统也称工作站，其包括硬件、软件和接口，用作数据采集、存储、处理、检索和仪器自动控制。6.9仪器性能指标6.9.1液相色谱的性能指标液相色谱的性能指标包括泵的最大工作压力、压力脉动、流量范围、流量精密度、流量准确度、梯度混合精密度、梯度混合准确度、梯度延迟体积、自动进样精密度、自动进样量的样品污染度。6.9.2质谱的性能指标质谱的性能指标包括分辨率、灵敏度、质量范围、质量稳定性、线性范围、检测限、质量准确性、峰面积(或峰高)重复性、离子丰度比重复性、保留时间重复性。7仪器安装环境要求、安全及注意事项7.1仪器安装环境要求：a)温度应在20℃~30℃,相对湿度应小于70%;b)避免震动和阳光直射；c)工作环境应清洁无尘、无腐蚀性气体，避免高浓度有机溶剂蒸气，有良好的通风；d)避免强磁场和电场干扰。5a)液氮罐运输时只能立放，不能躺放，为了防止翻倒，须用皮带或其他物品固定，为了缓和冲击，应使用海绵或其他软垫垫底；严防冲击和碰撞；使用前检查容器内部是否清洁干燥；长期存放液氮的房间应开窗通风、换气等；b)直接接触仪器内部有可能引起电击，在检查和维修时，应先切断电源；c)当使用压力容器内气体时，要遵从相关规定。如果其容器置于仪器附近，则应将容器固定到基7.3注意事项：a)在操作仪器前，要检查仪器管路、接头等处是否漏液和漏气；b)定期检查真空泵泵油，定期检查供气系统(碰撞气、雾化气等)的压力情况；c)仪器在待机和开机状态下，应保证足够的气源供应。应时常检查液氮罐液位(或氮气发生器的工作状态),若供气不足应及时更换液氮罐(维修氮气发生器);d)仪器室环境温度应控制低于仪器所要求范围，室温过高，会导致质谱仪热保护关机；e)液相色谱-质谱联用仪接口避免进入不挥发的缓冲盐溶液；f)电源电压、容量和频率应满足仪器要求且应稳定；g)仪器应接地。8分析步骤8.1取样及预处理操作按GB/T16631—2008中6.1规定。8.1.2预处理液相色谱-质谱联用分析中有多种预处理方法，如：溶剂萃取、快速溶剂萃取、超临界萃取、薄层色谱、柱色谱、固相萃取、固相微萃取、排阻色谱净化、免疫亲和萃取、分子印迹固相萃取、微波辅助萃取、化学衍生化、生物样品预处理等，样品溶液在进样之前需要进过滤处理。如果有专项标准，则按该标准进行预处理；如果加入内标物，在色谱图上内标物应与样品基质分离良好，其保留时间应与目标组分的保留时间差别不大。预处理有可能引起来自试剂、容器、环境等的污染，引起杂质的混入以及分析物的损失，应引起注意。8.2液相色谱操作过程8.2.1色谱柱的选用色谱柱的型号规格各有不同，色谱柱的标记除了柱填料的名称外，还要指明色谱管的材料、长度和内径。用作色谱柱管的材料应有足够的强度、有光滑的内表面、对洗脱剂和分析物惰性。根据分析品的类型、进样量和特点及分析条件，色谱柱有不同的尺寸，按内径的不同可以将色谱柱分类如下：a)半制备柱：内径12mm～50mm(不含50mm);b)通用柱：内径3mm～12mm(不含12mm);c)半微柱：内径1mm～3mm(不含3mm);d)微柱：内径1mm以下。68.2.2液相色谱模式的确定和流动相配制按照目标物质的分析要求，应确定液相色谱的模式是等度洗脱还是梯度洗脱。流动相都应当过滤和脱气，在输液系统的贮器内存放的超纯水最多不超过48h,最好一天内更换。若含有有机溶剂的水相还可稍长。8.2.3液路系统脱气更换流动相后，应在液相色谱泵的排液口抽吸输液系统内的流动相，使后者充满整个管路，达到脱气的目的。分析目标物质首先应考虑合适的色谱柱。可在液相色谱泵运转的情况下将管路与更换的色谱柱相接，以避免接头处留存空气。更换下来的色谱柱则需要合适的保存。8.2.5色谱柱的平衡色谱柱平衡的时间取决于柱长、流量及被分析物的性质，以观察保留时间的重复情况为准。柱的平衡不仅局限于运行液相色谱-质谱联用仪的开始阶段，当从一个分析项目转到另一个分析项目时也需要再次平衡，否则会影响结果的重现性。8.2.6色谱实验条件的设置液相色谱的实验条件包括：洗脱模式、流量、柱温、自动进样器的工作参数(包括吸液体积、吸液速度、进样针吸液位置、洗针程序等)、流动相的配比、梯度洗脱程序、等度洗脱时间等。8.3质谱仪操作过程当质谱仪的高真空达到要求值并处于稳定状态后，通过直接进样口注射标准溶液对仪器进行调谐。利用标准溶液检查质谱仪质量坐标的准确性，通过自动或手动调节仪器的各项电参数和各气体的流量。调谐可以理解为对仪器的校准，表3为校准用标准溶液浓度、配制及对应校准项目。表3校准用标准溶液浓度、配制及对应校准项目标准物质或试剂溶剂浓度校正项目利血平溶液标准物质异丙醇：水=1:1(体积比)峰面积重复性、离子丰度比重复性和质量准确性利血平标准溶液A液相色谱流动相分辨率，信噪比和峰面积重复性利血平标准溶液B液相色谱流动相信噪比和峰面积重复性PPG425、PPG1000、PPG2000混合标准溶液含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的甲醇水溶液甲醇：水=1:1(体积比)质量准确性咖啡因(质量分数>95%)质量准确性黄体酮(质量分数>95%)质量准确性7仪器在达到柱平衡后观察基线在测定的质量范围内是否有漂移，本底信号值有多大，以及有哪些杂质峰等。在基线符合要求的前提下应注意靠近目标物质保留时间处是否有明显的干扰。使用标准溶液进行优化是常采用的方法，优化过程中可以实现电参数和气流流量的自动优化。8.3.4质谱实验条件的设置质谱实验条件包括：离子化模式、正负离子选择、分析模式、起始和结束的质量数、扫描速度或每秒获得的谱图数、特征离子或离子对、驻留时间、质谱峰的采样频率等。8.4数据处理和结果报告8.4.1数据处理8.4.1.1定性分析定性分析主要依赖于液相色谱的保留时间和质谱数据，前者在相同的实验条件下要求被分析物质与标样之间保留时间的相对偏差允许为士2.5%以内。对后者而言，通过数据的处理，如谱图累加、本底扣除或谱图相减，以便有效的进行二者比对。在相同条件下分析标样和样品，得到谱图，将稀释标准溶液或混合稀释标准溶液的保留数据(保留时间、保留体积、调整保留体积、特征保留体积、相对保留值、保留系数等)与样品中未知组分的保留数据进行比较，可进行定性分析。在这种情况下，为了确认未知组分峰的单一性，可以改变分离条件进行测定，如改变流动相和固定相，也可使用其他定性技术来进行验证。定性分析还可以通过一些数据进行定性，如：TIC或EIC色谱峰的保留时间，质荷比m/z,化合物或离子的分子量、分子式、不饱和度，质谱峰的同位素丰度比、结构信息和氮规律以及多级质谱等。数据处理的工作集中在基线的设定，峰检出的参数调整，峰的平滑，重叠峰的界定。通过校准曲线和面积积分获得定量结果。此处使用校准曲线而不使用标准曲线表明，在复杂基体存在时目标物的定量测量应当是在相同或者相近基体存在的情况下建立相应输出量与标样量(或浓度)的关系曲线。样品的测定可以通过标准曲线法、内标法、标准加入法等方法进行测定。制备不少于5个梯度浓度的分析物的标准溶液(除空白样),每个稀释的标准溶液，取一定体积进样，记录色谱图，计算每个峰的面积。横坐标上取所进的稀释的标准溶液中分析物的量M