GB∕ T 40448-2021 麦角检疫鉴定方法（正式版）

GB/T40448—2021国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40448—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。1GB/T40448—2021麦角检疫鉴定方法本文件描述了麦角的检疫鉴定方法。本文件适用于植物及其产品中麦角的检疫鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。本文件没有需要界定的术语和定义。4麦角基本信息分类地位：真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,子囊菌亚门Ascomycotina,盘菌亚门Pezizomyco-tina,粪壳菌纲Sordariomycetes,肉座菌目Hypocreales,麦角菌科Clavicipitaceae,麦角菌属Claviceps。无性世代属无性菌类Deuteromycetes,丛梗孢目Moniliales,瘤座孢科Tuberculariaceae,蜜孢霉属麦角的其他信息参见附录A。5方法原理PCR扩增片段大小和测序结果等特征进行结果判定。2EDTA,NaOH,KCl,CTAB,TBE,蛋白酶K,三氯甲烷，苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，3mol/L6.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯浸粉5.0g,葡萄糖20.7检疫鉴定方法取样品量1%～5%(若样品少可适量增大比例)的植物及植物产品，用孔径2.5mm～10.0mm的将麦角放入70%乙醇浸泡30s进行表面消毒，移至1.3%的次氯酸钠溶液中浸泡1.5min,再用无将三角瓶中菌丝转到含PDA培养基的培养基上，22℃~25℃培养4d,用4mm的打孔器在菌落7.5.1DNA提取或CTAB方法提取麦角DNA(按照附录C进行操作)。引物1:ITS通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'/ITS4:5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3'引物2:β-微管蛋白基因通用引物Bt2a:5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'/Bt2b:5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'GB/T40448—202125μLPCR反应体系中含有：10×PCR缓冲液(含25mmol/LMgCl₂)2.5μL,2.5mmol/LdNTP0.5μL,20μmol/L正义引物和反义引物各1.0pL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL,50ng/μLDNAPCR反应程序为：95℃变性3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环；7.5.3PCR扩增产物检测扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。将PCR产物送到公认的测序公司进行测序，NCBI网站比对测序结果。8鉴定特征病菌形态特征图参见附录D。9结果判定a)如病菌与第8章描述的鉴定指标相符，则可判定检出麦角；b)如病菌与8.1描述的鉴定指标相符，同时利用ITS通用引物ITS1与ITS4经PCR扩增得到样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。从检测样品中分离并鉴定为麦角的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，20℃~25℃培养5d,然后4℃冰箱保存，或将菌丝块转入20%灭菌甘油并混匀，-80℃长期保存。对不需要34GB/T40448—2021长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。10.3结果记录与资料保存和审核人员签字。5GB/T40448—2021(资料性)A.1寄主范围野麦(E.mollis)、匍匐冰草(E.repens)、老芒麦(E.sibiricus)、异源四倍体披碱草(E.trachycaulus)、羊茅属(Festuca)、苇状羊茅(F.arundicuroides)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、草地早熟禾(P.pratensis)、犬草(Roegneriasibiricus)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、小麦属(Triticum)、普通小麦(T.aestivum)、高粱属A.2为害症状达40%～60%。A.4分布(国家和地区)6GB/T40448—2021A.4.2非洲麦角菌(ClavicepsafricanaFrederickson,Mantle&deMilliano)的分布A.4.3百慕大草麦角(ClavicepscynodontisLangdon1954)的分布A.4.8Clavicepspallida(G.Winter)Henn.1899的分布A.4.9雀稗麦角(lavicepspaspaliStev.&Hall)的分布7GB/T40448—2021A.4.10蜀黍麦角菌(ClavicepssorghiKulkarniSeshadri&Hegde.)的分布A.5侵染循环麦角(即菌核)与作物同时成熟。当作物收获时，麦角掉落土中或混入种子中，病菌菌核在土壤中越冬，春季萌发出土，每个麦角萌发生出10个～20个子实体，子实体呈蘑菇状，头部膨大呈圆球形，称子座，其直径1mm～2mm,灰白色或紫红色，下有一长而弯曲的细柄。子座表层下埋生一层子囊壳，子囊壳瓶状孔口稍突出于子座的表面，每个子囊壳内产生数个长圆筒形子囊，每个子囊内产生8个线状的单细胞的子囊孢子。到作物开花时，子囊孢子借风雨、昆虫传播到寄主植物的花部，侵染小花。经7d左右产生黄色蜜露状黏液，约半月后形成菌核。菌核成熟后落入土中，越冬后成为第二年初侵染的主要来源。蜜露黏液内有大量分生孢子，由昆虫将黏附在体上的孢子由病株带到健株而传播病害。此外，孢子还可借风力和雨滴飞溅传播或病穗直接碰撞扩大传播。种子中混杂的菌核也是侵染来源之一。作物开花后20d,被侵染的子房就变成坚硬的麦角。A.6流行规律寄主植物开花期愈长，作物的外颖张得愈大，受侵染的机会愈多。开花期间潮湿多雨，有利于病菌的传播和侵染。春季地面湿润，菌核易于萌发。菌核贮存一年以上便丧失生命力。菌核的孢子可由风散布到很远的范围。麦类作物容易发生麦角病的次序是：黑麦>小黑麦>大麦>硬粒小麦>普通小麦>燕麦。8GB/T40448—2021(资料性)麦角检疫鉴定流程图麦角检疫鉴定流程图见图B.1。症状检查形态鉴定分子生物学鉴定NCBI数据库比对，j预期月标种序列最为接近符合病原菌形态特征检山麦角检出麦角麦角萌发图B.1麦角检疫鉴定流程图9GB/T40448—2021(规范性)麦角DNA的提取方法C.1试剂盒提取麦角DNA的方法C.1.1将麦角样品用液氮碾碎。C.1.2取40mg到1.5mLEP管，加600μL核酸裂解C.1.365℃水浴20min,温和的混匀。C.1.714000r/min离心3min,取上清600μL。C.1.1014000r/min离心1min,弃上清(用枪吸干),放置于吸水纸上晾干(15min)。C.1.11加入100μLDNA重悬液，如果DNA很少，就加30μL,65℃温育1h或4℃过夜。C.2CTAB法提取麦角DNA的方法C.2.1称取经液氮处理的疑似麦角物质粉末0.1g,移到灭菌的2.0mL离心管中。离心管中加入300μL～500pμLCTAB缓冲液(其中含0.1g蛋白酶K)混匀，65℃水浴1h。三氯甲烷：异戊醇(24:1)混匀；13000g离心5min～10min,保留上清液；再加入500μL三氯甲烷：异戊醇(24:1)混匀；13000g离心5min～10min,保留上清液。C.2.3加入1mL异丙醇轻轻混匀，-70℃放置1h或-20℃过夜；13000g离心30min,可见DNA(资料性)禾草麦角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883为害症状以及病菌形态特征D.1禾草麦角菌Claviceps禾草麦角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883为害症状GB/T40448—2021图D.3禾草麦角菌核及其萌发注2:引自https://www.pflanzenkrankheiten.ch/)。图D.4禾草麦角菌形态特征D.2禾草麦角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883形态特征描述菌核细长呈香蕉形，圆柱形，端部是圆形的，并且笔直至锐利弯曲。果皮坚硬，紫黑色，有皱纹或有纵脊，菌核的内部灰色到白色，(10mm～25mm)×3mm;子座柄细长，头部扁球形，直径1mm~2mm,红褐色，外缘生子囊壳；子囊壳全部埋于子座内或稍外露，(200子囊细长呈棍状，(100μm～125pm)×4μm,先端壁厚，有中心孔，含8个丝状的子囊状子囊孢子；子囊GB/T40448—2021麦角蜜孢霉，在寄主子房内的菌丝垫中形成不规则的腔室，产生孢子；分生孢子卵形、单胞、无色，(4μm～6μm)×(2μm～3μm);它们混在黏液中溢出小穗外。菌核的大的大小而增加。黑麦的菌核可能比小麦的菌核更深裂。GB/T40448—2021[1]刘家熙.麦角菌[J].生物学通报，1997,32(4):17.[2]方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社.1998.[3]孙相辉，纪燕玲等.部分禾本科植物麦角病的发生及其病原真菌的特征[J].草业科学，2008.Vol.25,No.12:104-110.[5]SylviePazoutová,JanaOlsovská,MarekLinka,RenataKolínská,andMiroslavFlieger.Che-moracesandHabitatSpecializationofClavicepspurpureaPopulations.January2001;AppliedandEn-vironmentalMicrobiology66(12):5419-25.[6]M.Cerria,L.Realea,C.Morettia,R.Buonaurioa,etal.Clavicepsarundinisidentificationanditsroleinthedie-backsyndromeofPhragmitesaustralispopulationsincentralItaly.PlantBiosystems-AnInternationalJournalDealingwithallAspectsofPlantBiology,2017.[7]LionelN.Eleuterius&.SamuelP.Meyers.ClavicepsPurpureaonSpartinainCoastalMar-shes.Mycologia,2018,66(6):978-986.[8]AlisonJ.Fisher,J.M.DiTomaso,andT.R.Gordon.Conidialmorphologyandecologicalchar-acteristicsasdiagnostictoolsforidentifyingClavicepspurpureafromsalt-marshhabitats.CanadianJournalofPlantPathology.2005.27:389-395.[9]PazoutováS,etal.,DelimitationofcrypticspeciesinsideCla