2011CB944300-G精子遗传信息稳定传递的分子机理

项目名称：精子遗传信息稳定传递的分子机理首席科学家：沙家豪南京医科大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：江苏省科技厅

二、预期目标总体目标：本项目以阐明精子遗传信息稳定传递的分子机理为目标，通过实验动物模型与临床人群资源相结合开展相关基因的功能研究，探讨在精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形过程中建立父源遗传物质稳定传递的结构和功能基础，为人类生殖和发育相关疾病诊治提供理论基础。五年预期目标1.制备和引进5-8个精原细胞有丝分裂相关的基因敲除小鼠模型，揭示染色体复制修复、染色体分离和染色体结构对精原细胞的DNA稳定性的影响及其机制。2.制备和引进2-3个精母细胞减数分裂相关的基因敲除/转基因小鼠模型，探讨DNA损伤修复机制在维持精母细胞减数分裂基因组完整性方面的作用；在整体水平上了解泛素化和SUMO化蛋白在减数分裂过程中的时空和动态变化。3.制备和引进3-5个精子细胞变形相关的基因敲除小鼠模型，阐明在精子细胞形态建成过程中遗传信息稳定的分子机理。4.通过基因组学和蛋白质组学技术筛选临床不育人群的遗传变异和蛋白表达修饰异常，阐述上述研究的基因及其他精子发生相关基因在精子发生障碍中的作用及其分子机理。5.预期在本领域一流、生命科学有重要影响刊物上发表论文40-50篇，其中IF＞5的论文10-15篇，力争发表IF>10的论文1-2篇。6.在精子发生的研究领域集聚一支高水平的科研队伍，培养博士和硕士研究生20-30名。

三、研究方案本项目将基础研究与临床研究紧密结合，一方面利用精子发生障碍人群资源(主要选择无精子症、少精子症、弱精子症和畸形精子症等)筛选出与精子发生相关的基因/蛋白质，在此基础上进一步制备基因敲除小鼠深入探讨其在精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形过程中的作用；另一方面选择与上述过程相关的基因敲除小鼠模型，在临床上验证该基因与精子发生障碍的相关性。从基础-临床-基础，在各课题组已有工作的基础上，发挥各自的技术特点和优势，集中目标，重点突破。在基因水平、蛋白质水平、细胞与组织水平和整体水平上，综合应用生物信息学、分子生物学、生殖生物学、表观遗传学以及系统生物学等多学科交叉手段，各课题间既有侧重点又有交叉，系统深入地研究精子遗传信息稳定传递的分子机理。创新点与特色、可行性分析：1.从学术思路来看，本项目将基础研究与临床研究密切结合，从临床提出问题，到基础研究中寻找答案，再回到临床验证可行性。2.从技术手段来看，本项目综合运用多种技术平台，围绕精子遗传信息稳定传递的重要事件开展一系列研究。3.从研究对象来看，本项目已经收集近千例临床精子发生障碍患者的精液和外周血标本，同时南京医科大学附属医院和北京大学深圳医院还可以源源不断提供不育症病人的标本，资源丰富。4.从研究内容和课题设置来看，本项目6个承担单位之间的研究内容相互交叉，互相渗透，密切合作，形成一个统一的整体（详见课题设置）。5.本项目以国家目标为导向，以强强联合、优势互补、成果集成为组建原则，项目主要参加单位包括南京医科大学生殖医学国家重点实验室培育基地、中科院动物所生殖生物学国家重点实验室、中国医学科学院医学分子生物学国家重点实验室、南京大学科技部国家小鼠资源中心、中科院北京基因组学研究所和北京大学深圳医院；参加项目的PI有中科院院士1名、工程院院士１名、国家杰出青年基金获得者1名、中科院百人计划获得者3名、教育部百篇优秀博士论文获得者1名等，具备取得重大突破的科学积累和人才基础。课题设置各课题间相互关系围绕我们要解决的关键科学问题和达到的研究目标，本项目设置了4个课题:1.精原细胞有丝分裂及遗传稳定的调控机制2.减数分裂中DNA重组、修复及稳定性3.精子细胞形态建成的调控机制4.精子发生相关基因的人群研究四个课题之间相互交叉，互相渗透，密切合作，形成一个统一的整体，前三个课题是围绕精子发生过程中的三个重要过程设置的基础性研究，所制备的基因敲除小鼠平台不仅可以深入研究精子遗传信息稳定传递过程中相关基因和蛋白的功能，而且可以作为第四个课题进行临床精子发生障碍人群研究筛选基因的重要依据。而第四个课题中运用高通量筛选出的突变基因又可以为前三个课题提供可研究的基因资源。除此之外，由于四个课题具有高度关联性，在项目实施的过程中通过课题之间的渗透合作和交叉，能获得突破性进展。课题一：经费比例：20%承担单位：南京医科大学、南京大学课题负责人：黄晓燕学术骨干：黄行许课题二：经费比例：30%承担单位：中国科学院北京基因组研究所、中国科学院动物研究所、中国医学科学院基础医学研究所课题负责人：郭彩霞学术骨干：刘以训、王琳芳课题三：经费比例：30%承担单位：中国科学院动物研究所、北京大学深圳医院课题负责人：李卫学术骨干：高飞、桂耀庭课题四：经费比例：20%承担单位：南京医科大学课题负责人：沙家豪学术骨干：胡志斌、郭雪江

四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1、构建和引进精原细胞特异性基因、精母细胞减数分裂相关基因以及精子细胞变形相关基因条件敲除小鼠模型；2、对已有的基因敲除小鼠模型进行表型分析，探讨其与精子发生各个阶段可能的关系；3、制备酵母的HBT-UB/SUMO过表达体系，构建小鼠过表达载体。4、收集符合纳入标准的精液质量异常的患者和正常男性对照各2000例，采集基础流行病学信息和精液、血液、尿液等生物样本，针对不同表型（无精、少精、弱精和畸形精子）进行分组。通过各研究内容的实施，逐步建立相关生物样本库（包括精液、尿液、血液、DNA、组织等生物样本），为课题提供适宜的样本资源。1、成功建立和引进多种与精子发生相关的条件敲除小鼠模型，为后续研究提供动物模型。2、构建酵母和小鼠的HBT-UB过表达体系，并制备相应的酵母株系3、完成2000精液质量异常患者和2000正常男性对照基础流行病学信息、精液、血液和尿液等生物样本的收集，完成生殖功能评价，完成相关生物样本库的建立第二年1、继续构建和引进精原细胞特异性基因、精母细胞减数分裂相关基因以及精子细胞变形相关基因条件敲除小鼠模型；2、总结分析前一年已经构建好的小鼠模型的表型分析结果，探讨其与精子发生各个阶段的相关性。3、纯化并进行质谱分析酵母减数分裂过程中被泛素或者是SUMO修饰的蛋白。4、以临床无精子症患者为代表，选择课题1-3所研究的基因、其他文献报道的精子发生障碍相关基因等，对其全部外显子进行深度测序，筛选和验证突变，研究这些突变与精子发生的相关性；以临床少、弱精子症为主要表型，选择课题1-3所研究的基因、其他文献报道的精子发生障碍相关基因和DNA修复、凋亡等基因，进行生物信息学分析，选择可能影响基因表达和调控及引起氨基酸改变的SNPs，定制高通量芯片。5、收集临床弱精及畸精患者精液标本与正常对照精液标本，使用蛋白质组学策略鉴定差异表达蛋白。继续成功建立和引进多种与精子发生相关的条件敲除小鼠模型，为后续研究提供动物模型。获得与精子发生相关基因敲除小鼠表型分析结果。获得减数分裂过程中被泛素或者是SUMO修饰的蛋白变化谱。4、完成临床无精子患者所选基因全外显子深度测序，根据筛选和验证结果，进行关联分析；临床少、弱精子患者开始进行所选基因SNP位点的设计，定制高通量芯片及相关试剂。5、筛选出弱精子症以及畸形精子症精子重要的差异表达蛋白,完成这些蛋白的表达验证。6、在国际主流杂志（IF>3）上发表论文10-12篇第三年1、继续总结分析前一年已经构建好的小鼠模型的表型分析结果，探讨其与精子发生各个阶段的相关性。2、纯化并进行质谱分析小鼠减数分裂过程中以及精子发生相关的其他过程中被泛素或者是SUMO修饰的蛋白。进一步通过离体和在体实验相结合的方式验证其是否真的被泛素/SUMO化，研究这一泛素/SUMO化所需要的信号通路以及催化机制问题。3、在前一年工作基础上，采用定制芯片等高通量方法分析精子发生重要基因与精子发生障碍之间的联系。对于发现的与精子发生障碍存在关联的阳性位点，进行SNP的功能分析，确认后对所在基因反馈给课题1-3进行动物模型研究。4、对于深度测序获得的关联阳性位点进行功能研究；验证弱精子症与畸形精子症精子差异表达蛋白的改变。5构建弱精症精子蛋白差异磷酸化修饰谱。1、获得与精子发生相关基因敲除小鼠表型分析结果。2、获取小鼠减数分裂和精子发生过程中被泛素和SUMO所修饰的蛋白，并通过其他试验对其进行验证3、完成临床少、弱精子症患者相关基因SNP和突变的检测和分析，对阳性关联位点进行功能学分析及/或进一步的动物模型研究；完成弱精子与畸形精子症精子差异蛋白表达谱的验证工作；完成弱精子症精子差异磷酸化修饰谱的构建。4、在国际主流杂志（IF>3）上发表论文10-12篇第四年1、继续总结分析前一年已经构建好的小鼠模型的表型分析结果，探讨其与精子发生各个阶段的相关性。2、在酵母和小鼠中通过必要的生物学手段探讨相应被泛素化修饰的蛋白在减数分裂过程中以及精子发生过程中的作用机制问题，并根据情况构建相应购得动物模型开展深入研究3、验证弱精症精子蛋白差异磷酸化修饰谱；构建少精子症精子差异蛋白表达谱；构建畸形精子症差异磷酸化修饰谱1、获得与精子发生相关基因敲除小鼠表型分析结果。2、阐明几个被蛋白的泛素化修饰在减数分裂过程中以及精子发生过程中的作用机制问题。3、完成弱精子症精子差异磷酸化修饰的验证；完成少精子症精子差异蛋白表达谱的构建和验证。完成畸形精子症精子差异磷酸化修饰谱的鉴定。4、在国际主流杂志（IF>3）上发表论文10-15篇第五年1、完成和整理上述基因敲除小鼠的表型分析和作用机理研究2、在临床人群研究方面，完成所有研究内容并探索临床和人群转化潜力3、总结课题，汇总数据，设计好新的研究计划。1、通过基因敲除小鼠模型的构建以及表型分析，获得对精子发生各个阶段：精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂以及精子细胞变形过程关键基因的作用机理，并对每一个敲除小鼠表型与课题四开展的临床精子发生障碍模型相关基因的研究进行比对分析，从基础和临床两个水平探讨精子遗传信息稳定传递的分子机理2、在国际主流杂志（IF>3）上发表论文10-12篇，其中五年之内争取发表IF>10文章1-2篇

一、研究内容精子发生是一个连续的细胞分裂分化过程，其最终目的是维持父系遗传信息的稳定传递。本项目拟通过基础研究与临床研究的紧密结合，阐明精子建立遗传物质稳定传递的分子基础。围绕着这个