色谱分析法导论

关于色谱分析法导论2024/8/612024/8/621、色谱法的产生

色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。一、色谱分析法简介第一节

概述

第2页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/63（1）CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来。（2）被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。第3页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/64Tsweet的实验第4页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/65第5页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/66色谱法中共使用两相固定相—固定不动的相CaCO3

流动相—推动混合物流动的液体石油醚色谱法：混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。

第6页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/67固定相：（1）固体吸附剂：CaCO3、Al2O3等（2）液体固定相（载体+固定液——高沸点有机化合物，涂在载体上）色谱分离法一定是先分离。后分析一定具有两相；固定相和流动相分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离第7页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/68色谱法的特点“三高”、“一快”、“一广”高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、分析第8页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/69气相色谱高效液相色谱薄层色谱纸色谱柱色谱经典液相色谱法色谱－光谱联用多维色谱智能色谱超临界流体色谱毛细管电泳法2.色谱法的发展第9页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/610二、色谱分析法分类1、按两相状态分类气相色谱—气体作流动相

（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相。（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。第10页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/611液相色谱—液体作流动相（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相。（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。超临界液体色谱——超临界流体作色谱流动相。

第11页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6122、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱—固定相填充到柱管内毛细管柱色谱—把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。第12页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6133、按分离原理分类

固定相分离机制吸附色谱吸附剂吸附能力分配色谱液体分配系数或溶解度离子交换色谱离子交换剂交换能力或亲和力分子排阻色谱凝胶或分子筛阻滞或渗透作用第13页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/614色谱与光谱的区别：色谱具有分离与分析两种功能光谱没有分离功能第14页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/615第二节色谱过程和基本原理

一、色谱过程

实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。

色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。第15页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/616二、色谱图中的基本术语

1.色谱图（chromatogram）

混合物样品（A+B）→色谱柱中分离→检测器→记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线。（一）色谱流出曲线与色谱峰第16页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6172.基线（baseline）在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下，一条直线。基线上下波动称为噪音。第17页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6183.色谱峰（peak）是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰、拖尾峰和前延峰对称因子fs

(symmetryfactor)：0.95~1.05对称峰

<0.95前延峰

>1.05拖尾峰第18页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/619（二）色谱保留值——定性的依据

组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。第19页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6201.死时间(deadtime)

t0——不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。第20页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6212.保留时间tR(retentiontime)组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。第21页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6223.调整保留时间t’R(adjustedretentiontime)—扣除了死时间的保留时间。t’R=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。

t’R体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。

t’R第22页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6234.保留体积VR(retentionvolumn)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。

5.死体积V0（deadvolumn）—不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。

第23页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6246.调整保留体积

(adjustedretention volume)：由保留体积扣除死体积后的体积7.相对保留值r(relativeretention)：两组分的调整保留值之比注意：VR’是定值，tR’与FC成反比第24页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6251.色谱峰的高度h(peakheight)-色谱峰最高点与基线之间的距离，可用mm,mV，mA表示。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。

(三)定量参数第25页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/626

2.色谱峰面积A（peakarea）

——色谱峰与基线所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

第26页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/627峰宽W（peakwidth）—色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离W

=4σ

半峰宽W1/2(peakwidthathalfheight)—峰高一半处色谱峰的宽度W1/2

=2.354σW

=1.699W1/2标准偏差σ(standarddeviation)—峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。(四)区域宽度第27页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/628第28页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/629(五)分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色 谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。第29页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/630★定量分析时，要求R≥1.5分离度R分离程度分离情况0.889％未分离198％基本分离1.599.7％完全分离第30页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/631第31页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/632三、分配平衡在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和容量因子k来表示。

=cs/cm组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K=1、分配系数K(distributioncoefficient)第32页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/633影响分配系数的因素：★组分的性质★固定相和流动相的性质★温度：T越大，K越小第33页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/634★

K越大，Cs越大，在柱中停留的时间越长，组分就后流出色谱柱；★

K越小，Cs越小，在柱中停留的时间越短，组分就先流出色谱柱。

★

K=0，组分不被固定相保留，最先流出。混合物中各组分的K相差越大，就越容易分离。第34页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6352、容量因子k(capacityfactor)组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量=ms/mm=Kvs/vm

k=k随T、固定相、流动相的体积变化而变化k越大，组分在固定相中质量越多，tR越长K、k越大，组分在固定相中tR就越长第35页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/636★

色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中K的差异而分离。∴分离的前提：K不等。要求组分间必须有差速迁移，即tR不等。第36页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/637第三节色谱法的基本理论

一、塔板理论

在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法。第37页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/638分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。第38页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/639塔板理论假定：①在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。②流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。③分配系数在各塔板内是常数。④纵向扩散可以忽略。第39页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/640（一）质量分配和转移1、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移

①设色谱柱的塔板数n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）号。

②将单位质量的B加到第0号塔板上。

③分配平衡后，0号塔板内ms/mm＝ 0.333/0.667。

④进入一个塔板体积的流动相（一次转移），第40页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/641第41页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/642经过N次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。如N=3，展开式为：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0123号在固定相和流动相中的质量分布由k(K)决定第42页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/643转移N次后，第r号塔板中的质量Nmr：

第43页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/644例：转移3次后，在第2号塔板内的溶 质分数第44页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/645组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内及出口的分布

Nr01234柱出口010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.068第45页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/646注意：1、柱出口处的质量分数的计算。2、质量（浓度）最大点的N，即保留体积。第46页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6472、两组分的分离A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分第47页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/648组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布

Nr01234柱出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630

50.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.118

80.0040.0320.1110.2200.2740.137

90.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.124第48页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/649结果：组分B:k=0.5,当N=6和7时，柱出口产生B的浓度最大点。组分A：k=1，N=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。两组分开始分离，k小的组分B在柱后先出现浓度极大值,即先出柱。第49页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/650一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。 分配系数(容量因子)不等是分离的前提。第50页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/651

(二)流出曲线方程

1、二项式分布曲线 以组分A在柱出口处的质量分数对N作图。第51页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/652N柱出口0010203040

5

0.03260.07970.118

80.13790.137100.124

k=1的组分从n=5色谱柱中的流出曲线图第52页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6532、色谱流出曲线当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。第53页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/654第54页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/6553、色谱流出曲线方程（正态分布方程） 描述组分流出色谱柱的浓度变化：

为标准差，tR为保留时间，C为任意时间t时的浓度，C0为峰面积A，即相当于某组分的总量。第55页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/656t=tR时，C有极大值：Cmax即流出曲线的峰高h。σ一定时，峰高h取决于C0。C0一定时，峰高h取决于σ。第56页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/657流出曲线方程的常用形式：不论t＞tR或t＜tR时，浓度C恒小于Cmax。C随时间t向峰两侧对称下降。σ越小，峰越锐。σ是柱效的标志。第57页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/658色谱峰面积以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355σ，峰面积:A=h

σ(2

π)1/2A=1.065×W1/2×h

色谱定量的参数第58页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/659(三)理论塔板高度和理论塔板数

(heightequivalenttoatheoretical plate或plateheight,H) (platenumber,n)

是色谱柱效参数。第59页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/660理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：第60页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/661理论塔板高度

H=L/n

注意：1、计算n时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间单位一致

2、n的单位第61页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/662有效理论塔板数和有效理论塔板高度Hef=L/nef第62页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/663注意：★用nef和Hef作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。★当两组分的K相同时，无论该色谱柱的n多大，都无法分离。第63页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/664存在问题:★做出的四个假设与实际不符，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程。★只能定性给出塔板高度的概念，无法解释板高的影响因素。★排除了一个重要参数——流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速关系。第64页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/665二、速率理论——动力学观点VanDeemteer方程式：涡流扩散项纵向扩散项传质阻力项载气线流速(cm·s-1)u＝柱长L(cm)/死时间t0(s)理论塔板高度

(cm)u一定，A、B、C小，H小，柱效n高，峰尖锐第65页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/666（1）涡流扩散项A当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动（路径不同）→不能同时流出色谱柱（色谱峰扩张），故称涡流扩散。第66页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/667通常选粒度为60~100目的填充颗粒，并尽量填充均匀。但dp不能太小，否则不易填充均匀（λ大），且阻力（柱压）也大。填充不规则因子填充物颗粒的平均直径涡流扩散系数第67页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/668待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓→稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）

第68页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/669（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）

气体扩散路径弯曲因子组分在流动相中的扩散系数纵向扩散系数组分在固定相中的扩散很小，可忽略第69页,共77页，星期六，2024年，5月2024/8/670分子量↑柱温↓柱压↑B↓Dg↓tR↓（u↑）↓填充物B/u↓柱效↑H↓（n↑）填充柱＜1硅藻土担体0.5～0.7毛细管柱＝1

减小纵向扩散项Ｂ／u采取措施：第70页,共77页，星期六，2024年，5