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文档简介
第二章饲料氨基酸的分析
JohannesFontaine*
德国哈瑙应用技术德固萨有限公司饲料添加剂分公司
一、介绍
饲料加工者的获利对饲料中最佳且精确的氨基酸组成的依赖从没有像现在这样明显。
氨基酸对动物的生长和饲料转化的影响如此显著,以至现在全世界每年向饲料中添加的合成
蛋氨酸和赖氨酸都超过了400,000公吨。这使得我们更加需要对饲料原材料中的氨基酸进
行分析,从而为饲料线性规划改善氨基酸模型,而且使其成为一种配合饲料和预混料的质量
保证工具。
在本书第一版中A.P.Williams综述了到1992年为止,有关氨基酸分析方面的文献。在
第二版中,我们将重点介绍最近十年里的发展。现在有许多有关氨基酸分析的出版物,但仅
有一小部分与动物营养(如饲料原料、食品、植物、青贮料、植物和动物源副产品、动物血
浆、肠道和瘤胃内容物等)相关检验模型有关。在这里我们将对这些主题进行讨论。
近些年的一个重要发展无疑是早已成熟的分析饲料原料中氨基酸的国际标准。在二十
世纪八十年代欧洲监督机构的分析专家坚持欧盟的不同国家采用各自不同的氨基酸检测分
析方法,但最终也在国际间协作的氛围下,建立起了欧盟一种统一的分析方法。最近,在广
泛的研究背景之下,欧洲已经通过了对动物饲料原材料中总氨基酸和游离氨基酸的官方测定
方法和对色氨酸的测定方法(CommissionDirectives98/64/EC和2000/45/EC)。国际间协作
同时也是国际AOAC分析测定除色氨酸外全部氨基酸方法(AOAC,1994)建立的基础。
AOAC的官方分析方法作为包括北美自由贸易区(NAFTA)在内的全球各种分析方法的总
结,而被全球所承认。饲料分析推荐采用的方法是用荀三酮衍生阳离子交换树脂进行的色谱
法分离氨基酸。不同方法的样本制备本质上都相同。欧盟对饲料中色氨酸的标准测定步骤是
利用氢氧化钢碱水解和用特定荧光测定的HPLC分析技术。
另一种创新是对饲料原材料中氨基酸的近红外光谱(NIRS)测定方法的发展,这种方
法以可靠的湿化学分析为基础。这些使如今的原材料中氨基酸组成的快速而简单的分析和最
新的饲料优化成为可能。这一发展也将在此给予详细介绍。
Kivi(2000)所作的针对色谱法等检测方法的综述也值得特殊关注,因为它是对本综
述的极好补充。
二、湿化学分析
(-)样品制备
1.酸水解及氧化
氨基酸的测定需要蛋白质水解为不同的结构域,这些结构域由于其R侧链功能的不同
而具有不同的作用。天冬酰胺和谷氨酰胺失去侧链中的酰胺残基而分别形成天冬氨酸和谷氨
酸,反应产生的氨可以由色谱法检测出来,但是氨基酸分析只能测出天冬氨酸/酰胺和谷氨
酸/酰胺的总量。大部分色氨酸在酸水解中破坏,而蛋氨酸和胱氨酸部分氧化成几种衍生物。
欧盟和美国的标准水解条件是在110℃(盐酸沸点)下用6M盐酸水解24h。可以在回流装
置中进行,也可以在恒温烘箱的密闭容器中进行。这些条件可以使所有氨基酸得到最佳还原。
携带一个羟基基团的丝氨酸和苏氨酸随着水解时间的延长和酸性的增强而慢慢降解。异亮氨
酸、亮氨酸和缴氨酸等支链氨基酸,尤其当它们在蛋白质中相邻排列时,其被水解时空间位
阻的释放更加缓慢。Albin等(2000a,b)最近研究了这个课题,还研究了酸浓度对大豆产
*注:E-mail上也址:iohannes.tbntaine血
品的影响。Rowan等(1992)检测了水解时间(8-72h)对日粮、回肠食糜和粪便样本的
影响。标准条件下的最佳还原量通常是5—10%,有时可达20%或更高。作者都推荐使用矫
正因子。
在微波烘箱内150℃水解可以减少蛋白质分解为小分子所需的时间(Carisano,1992;
Joergensen和Thestrup,1995;Marconi等,1996;Shang和Wang/997;Kroll等,1998)。如果仅
能获得微量蛋白,那么使用气态氯化氢就好些(Schrijver等,1991;Molnar-Perl和Khalifa,
1994)。Fountoulakis和Lahm(1998)对蛋白质水解技术做了概述,其中还包括不常用的酸,
如甲烷酸或对甲苯磺酸,或是利用酶(Hauck,1990;Chen等,1996)。Weiss等(1998)利用
色谱纯化蛋白比较了不同水解技术。在欧盟标准方法(CommissionDirective98/64/EC)中,
水解的矫正因子像之前荷兰所实行的那样,被排除了。水解的侧链反应依赖于基质,并且可
能很大量,尤其是在微波水解中。所以,矫正因子应该在不同饲料原材料中分别给予定义,
尤其是在配合饲料中。而且,在编制原材料组成表时,应用不同的矫正因子将导致分析误差
的增加。另一方面,全球应用一致的标准水解条件才可能产生一致的氨基酸分析结果。含硫
氨基酸在蛋白质水解之前就被过甲酸氧化为蛋氨酸飒和磺基丙氨酸,它们存在于酸水解中,
损失很少。在欧盟和AOAC的官方方法中,每含10mg氮的样本对应于5ml过甲酸在0℃
过夜(16h)。在此之前,过甲酸是在室温下由4.5ml88%的过甲酸和0.5ml30%的过氧化
氢,再加少许苯酚配制而成,不可浓缩或储藏。几十年前这些反应条件就在Schram等人
(1954)的工作基础上标准化了。过量的过甲酸之后可以被加入的滨化氢或氯化氢还原,生
成澳或氯,由旋转蒸发器蒸发掉。Spindler等(1984)、Elkin和Griffith(1985),还有Gehrke
等(1987)研究了在这些条件下所有氨基酸的还原情况,他们的研究表明,除苯丙氨酸、组
氨酸和酪氨酸外的所有酸稳定氨基酸,在氧化之后都由水解产物完全还原了。Mason等
(1980a,b)和Bech-Andersen等(1990)试图精简这一步骤,提出通过加入焦亚硫酸钠盐
来还原过甲酸。它的好处是不再需要在水解前去除卤素,而且苯丙氨酸和组氨酸也可以从氧
化水解产物中测定出来。这种方法能够测定除色氨酸和酪氨酸以外的所有氨基酸。但是,这
样一来,水解产物就包括由去除了盐酸后而浓缩的亚硫酸盐所形成的硫磺酸或是硫酸,它们
可以由丝氨酸和苏氨酸合成硫酸酯,在氨基酸分析仪中将对磺基丙氨酸产生干扰。欧盟的方
法就是以这种方法为基础,对水解产物进行中和,这完全可以实现自动化,或是通过蒸饵去
除部分盐酸。口ames和Fontaine(1994)将这种改进了的氧化和酸水解方法与世界范围内
28个研究者合作参与的,针对小肉鸡和大肉鸡、玉米、鱼粉和鸡肉粉进行测定的试验结果
相比较,得到了相近的结果(表2.1)。Toran等(1996)还建议用氧化方法测定婴儿配方中
的胱氨酸和蛋氨酸。
Slump和Bos(1985)指出,如果添加剂或浓缩料中盐的氯水平超过1%,就会干扰蛋
氨酸的氧化。这使得过甲酸被部分降解,生成氯,于是仅磺基丙氨酸完全形成,而不是蛋氨
酸飒。如果这种方法可行,那么作者建议用稀释过的过甲酸进行氧化测定蛋氨酸,但并不适
用于胱氨酸。德国VDLUFA(1997)视此步骤为分析氯含量高的日粮中蛋氨酸的官方方法。
Tuan和Phillips(1997)的工作也值得一提,他们在1450c下,分不同时间在真空安甑管中
用盐酸水解时加入二硫化物和33-二硫代二丙酸的混合物,以此来研究以酪蛋白和高梁为
主的日粮和食糜中胱氨酸的还原情况。他们用100倍摩尔浓度的试剂还原胱氨酸的效率达到
99%.但是,在饲料和食糜中的得到的结果非常不一致,使得不能对这种方法进行评价。
2.色氨酸分析
色氨酸,这一必需氨基酸可能成为口粮中的限制性氨基酸,尤其是在母猪口粮中。目前
已经对其分析方法进行了广泛的研究。近些年,主要研究在完全无氧条件下进行碱水解来分
析。Simat和Steinhart(1998)最近发表了对游离和结合色氨酸氧化的详细研究过程,并对
其反应产物给予了描述。Nielsen和Hurrell(1984)在真空容器中用氢氧化钠另加内标5-
甲基色氨酸和水解淀粉水解(110℃,20h)进行对比试验。而Werner(1986)以及Rogers
和Pesti(1990)则在充氮气后,在无内标的情况下用氢氧化锂进行水解,因为氢氧化钠会
腐蚀玻璃。在他们的试验中,色氨酸还原率为97—99%。Slump等(1991)比较了在高压
灭菌锅内(130℃,8h)氢氧化锂和氢氧化钏的水解效果,仅在水解后添加了内在标准,且
获得了相同的还原效果,即先前估计的对确定蛋白和纯色氨酸的92%的还原率。
Bech-Andersen(1991)建议在灭菌锅内用氢氧化钠溶液添加乳糖进行水解,从而提高还原
率,并用a-甲基色氨酸作为内标。Ranfft和Faure(1993)利用14个欧洲试验室的不同内
部方法对配合饲料和四种饲料原材料进行相互比较,发现协方差的变化范围为4%(大豆)
到10%(玉米),且在所用氢氧化物、温度、时间或水解技术方面未看到显著差异。Landry
和Delhaye(I992a,b,1994a)以及Delhaye和Landry(1992,1993)在色氨酸的测定方面
进行了广泛的研究。水解时采用了三种氢氧化物、不同的反应时间和温度以及几种试验步骤,
并对各种变换进行了比较。他们最终得到结论,认为在高压灭菌锅内用氢氧化钢添加5-甲
基色氨酸作为内标来弥补损失而进行水解。他们还建议在反向(RP-)硅胶上的HPLC条件
应为独立反应10分钟,并用荧光检测。Landry和Delhaye(1994b)对所有协作研究得到的
色氨酸值进行了评估。他们认为以上条件使色氨酸的还原率提高15-20%。许多研究者建议
用紫外或荧光的HPLC技术进行检测,其中荧光检测因为其对色氨酸检测的特异性而更受
推崇。
Landry和Delhaye(1992a)还对用交联葡聚糖胶渗透进行的分离、用阳离子交换柱进
行的分析或在用对二甲氨基肉桂醛染色后的比色分析之间进行了比较。其他研究者还用由对
二甲氨基苯甲醛(Lee等,1996)或硝酸(Shan等,1996)转化形成的酸性苛三酮方法对色
氨酸进行了比色测定(Pinter-Szakacs和Molnar-Perl,1990)«不过,把这种方法与HPLC方
法进行比较,HPLC因为操作更简单且结果更精确而更受重视。对HPLC的广泛认同使得先
前普遍应用的分光光度法测色氨酸的方法渐渐消失。Molnar-Perl(1997)对分析肽和蛋白质
中色氨酸的各种方法进行了编辑,包括在饲料原材料中不常使用的技术,如酸水解或酶水解,
气相色谱法或没有化学衍生现象的衍生光谱法。Carisano(1993)在温度控制条件下用氢氧
化锂进行微波水解,使得肉和鱼在不到60分钟的时间内就全部水解,与用氢氧化钢在110℃
下水解12h得到的结果相似。他用邻苯二甲醛(OPA)在HPLC之前对色氨酸进行衍生,而
Algeria等(1996)用异硫氟酸苯酯(PITC)对色氨酸进行转化。
欧盟委员会的一个专家组,DGXII,已经在建立欧盟一致的饲料分析系统的相关研究上
进行了4年之久的研究。Fontaine等(1998)报道了由12-16研究者参加的三个合作试验结
果,试验比较了氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钢,比较了在水解当时和水解之后对内标的使
用,比较了5-甲基或a一甲基色氨酸作为内标的稳定性,并比较了真空或除氮的水解容器与
高压灭菌锅使用的差别。其中的试验参加者,Landry和Delhaye(1994b)提出了之前叙述
的观点,即在用氢氧化钢水解的过程中加入5-甲基色氨酸做内标,并且用他们特殊的高压
锅条件获得的色氨酸浓度比其它技术所得的高15%。然而,又一个合作试验表明,在不考
虑水解技术条件下,这种内标的使用时分析值比a-甲基色氨酸作为内标时显著提高
13-20%。比较两种内标的水解稳定性,得到5-甲基衍生物不如色氨酸稳定,而a-甲基色氨
酸显然比色氨酸更稳定。这导致对结合态色氨酸水解损失的过校正,从而使水解过程中内标
的添加受阻。在高压锅内用4M氢氧化钢水解是最佳的条件。而且,在水解后添加稳定的a
-甲基色氨酸可以提高各实验室之间试验结果的相似程度。测定添加的色氨酸的方法也得到
了优化,就是在内标存在情况下用0.1M盐酸进行水解。CommissionDirective2000年出版的
书中将所采用的方法在欧盟强制施行,其精确性很高,重复性CVR在2.2—6.3%之间,第二
次实验为1.5—4.7%之间。
(-)添加的或游离的氨基酸与牛磺酸
目前,所有配合饲料都添加氨基酸,并且对这种添加的测定是饲料工业重要的质量保
证工具。Fahnenstich和Tanner(1973)发展了一种用经稀释的0.1M冷盐酸从几克细粉料中
提取游离氨基酸的方法。Mason等(1980a)采用了相似的提取条件,但是添加硫代双乙醉
作为色谱分析前提取物中蛋氨酸和蛋白质沉淀物的稳定剂。CommissionDirective(1998)规
定的提取条件,实质上与欧盟的官方方法相同,遂将二者合并,用于测定饲料中的添加氨基
酸。在欧盟的合作试验中,用预混料对这种提取方法进行了测试,实验的CVr及各实验之间
的CVR都有很好的重复性(表2.2)。稀释后的盐酸不能引起蛋白质的水解。但是,我们不
能把添加的氨基酸和自然的饲料原材料以外的非蛋白结合氨基酸区分开。在进行阳离子交换
色谱之前需要做的就是将PH值调到2.20,并且据我们的经验所知,并不需要对提取物进行
特殊的清理。在我们实验室用正亮氨酸作内标对不同的配合饲料进行提取,可以得到较好的
1-1.5%的实验重复性(Fontaine,2002)。Foulon等(1990)比较了用水、85%乙醇和如前
所述的加了缓冲溶液的酸水解提取物对蛋氨酸和赖氨酸提取的效果,其中在用0.1M盐酸时
获得最佳还原率。Saurina和Hemandez-Cossou(1993)介绍了专门测定商业饲料中添加赖
氨酸含量的流动注射分光光度法。Bech-Andersen(1997)发展了在含重金属浓度高的矿物
质预混料中采用的碱/酸水解条件,从而得到不含重金属离子的提取物,因为重金属离子会
极大程度的干扰阳离子交换柱。Fontaine和Eudaimon(2000)详细介绍了在氨基酸分析仪
中用于测定的一种酸提取方法,尤其是用于测定商业氨基酸产品和浓缩预混料。他们在17
个国际合作试验中对这些产品进行了测定。他们的实验室间重复力CVR为1.5-2.6%,在精
确配制的预混料中氨基酸产品的还原率为97.5-102.8%。这种方法被AOAC国际组织采用,
作为官方首要方法。
日粮氨基酸对血浆、肌肉或肝脏等的游离氨基酸浓度的影响也成为许多动物试验所研
究的课题。这些模型需要加入酸或溶剂,通过物理方法(超滤等)进行脱蛋白沉淀。Walker
和Mills(1995)在综述中写到,在人类疾病的诊断工作中,沉淀物中主要含终浓度为4-5%
的5-磺基水杨酸,这在Jonge和Breuer(1994)在猪血浆,以及Hagen等(1993)在牛血浆
中得到的结论是一致的。Sedgwick等(1991)用丙酮或乙月青比较了在牛血浆和牛血清白蛋
白溶液中的蛋白质沉淀和高氯酸或三氯乙酸沉淀。酸沉淀的氨基酸在较宽泛的溶解蛋白质浓
度范围内(4-16%)的还原率较高。然而,在沉淀中含有游离氨基酸的溶剂随着蛋白质含量
的增加,其还原率降低到仅有50%。另一方面,Aristoy和Toldra(1991)在用高氯酸、三
氯乙酸、苦味酸和乙曙沉淀蛋白质或用10kDa排阻限进行超滤测定新鲜猪肉和干腌火腿时,
也得到了同样令人满意的结果。但是用磺基水杨酸或在1kDa时超滤得到的还原率较差。
Peter等(1999)也用三氯乙酸对海藻细胞提取物进行蛋白质沉淀,Bugueno等(1999)乙
晴对雄鱼肉进行脱蛋白。Antoine等(1999)用75%甲醇分析鱼肉样本中的游离氨基酸。还
有,Hara等(1999)用30%磺基水杨酸制备尿样。VandeMerbel等(1995)介绍了利用分
离蛋白的超滤技术和离子交换色谱进行发酵的过程中,对氨基酸的在线监控技术。因此,在
开始的试验中,需要测定去除多余蛋白的多种变量以及添加氨基酸的还原率。
半胱氨酸的代谢衍生物,牛磺酸为猫所必需,但在婴儿营养中也具有重要作用。它以
非结合形式存在,原则上也可用分析游离氨基酸的方法进行测定。Balschukat和Kunesch
(1989)介绍了在氨基酸分析仪中用0.1M高氯酸提取后,测定鱼粉、宠物饲料和动物原材
料中牛磺酸含量的方法。Nicolas等(1990)同时使用超滤和离子交换色谱方法对婴儿配方
奶粉和人乳中的牛磺酸浓度进行了测定。McCarthy等(2001)在一项合作试验中用酸水解
(6MHC1,110℃,16h)和丹磺酰氯的柱前衍生对宠物食品中的牛磺酸进行测定。六个湿
的和干的猫狗粮样本的实验室间重复性CVRS为6.1-13.3%,这一步骤成为AOAC国际组织
的官方方法。
Porter等(1988)、Amiss等(1990)、Sakai和Nagasawa(1992)以及Messing和Sturmann
(1993)介绍了用不同试剂的柱前衍生后HPLC分离来测定猫和其它物种血液和血浆中的
牛磺酸含量。
(三)色谱分离与测定
近来儿篇有关氨基酸分析的综述文章需要在此首先提及。Morr和Ha(1995)报道了食
品中蛋白质和氨基酸的普遍分析方法,而Rutherfurd和Moughan(2000)的工作主要集中在
分析动物饲料中的氨基酸。Molnar-Perl(2000)介绍了测定食品中糖、竣酸和氨基酸的色谱
技术,并提及气相色谱和毛细现象技术。Fekkes(1996)以及Walker和Mills(1995)对分
别在生理样本或生物液体中进行氨基酸测定的进展进行了报道。以分离程度为例,对不同色
谱技术进行了详细描述。
1.离子交换色谱(IEC)
通过阳离子交换柱(聚苯乙烯硫酸钠或锂盐)用三到五种柠檬酸盐,有时用具有不同离
子作用力、PH和不同修饰物的醋酸缓冲液进行所有氨基酸的色谱分离,这种方法从1948
年就开始发展,Spackman等人在1958年利用其原理发明了自动化氨基酸分析仪。50多年
后,这种方法因其突出且稳定的分离效果而成为氨基酸分析的标准方法,使我们可以分析血
浆中多余45种的氨基酸进行分析(锂缓冲液),沉积时间和达到最大量的范围都具有较高的
重复性,校准值也具有广泛的稳定性。考虑到配合饲料的复杂组成,树脂因其可以抵抗基质
的影响而具有重要的作用。污垢的加厚和分离效果的降低在多数情况下都可以通过简单的改
变流动方向而得以校正。在作者的实验室里,离子交换柱通常连续使用一年之久;然后才对
其进行清理,并再生树脂,重包装柱子。因此,一台氨基酸分析仪的运行耗费远远比使用
RP-HPLC柱少,因为后者不能再生且易受脂肪和饲料中的非极性物质所损害而需要经常更
换。我们通常用加热的线圈中的苛三酮或用OPA进行柱后衍生,后一试剂的敏感性大约是
前者的20倍。柱后衍生的主要好处是,每种氨基酸,无论是样本中的还是标样中的,都是
在各自的洗提缓冲液中利用相同的条件进行衍生。而且,衍生状态下的氨基酸在用色谱分析
时,比常规的HPLC柱前衍生具有更高的分化程度,柱前衍生时氨基上结合有一个很大的
非极性分子。而且,这种反应必须在相应的基质中进行,因为各自的基质可以影响反应产物
的量和衍生物的稳定性。Butikofer等(1992)主持了一项合作实验,在乳产品和饲料样品
中,对柱后衍生后的HPLC分析与作为经典的离子交换柱另一选择的OPA和氯甲酸-9-笏甲
酯(FMOC)的混合物方法进行了比较。虽然这两种方法得到的结果相似,但是正C的重复
性和精确性都较高,如果试验需要较高精确性的话,还是推荐使用IEC,因为IEC的设备技
术已经非常成熟,所以较少文章对其操作细节进行描写。Grunau和Swiader(1992)以及
Moeller(1993)在有两或三个洗提梯度的HPLC仪器中使用IEC柱。LeBoucher等(1997)
使用新的氨基酸分析仪一一HitachiL-8500A,用生物液体对具最高重复力的生产性能、沉积
时间稳定性和线性浓度作了广泛的测试,得到了较理想的结果。
2.其它对非衍生氨基酸的分离和检测技术
氨基酸的分离还可以用阴离子交换色谱与毛细管电泳脉冲安培法(PAF)相结合进行测
定。这种分离方法的原理很有趣,因为它的洗提顺序与阳离子交换柱是相反的,比如,精氨
酸和赖氨酸在短时间内就可洗提出来。PAD的金属电极涂有可氧化的有机基团,如含有羟
基、氨基和硫基的化合物,而不是无机盐或碳酸。Martens和Frankenberger(1992)成功地
将这种新方法运用在不同的蛋白和小麦变种上,虽然精氨酸(高)和谷氨酸的检测灵敏度差
异因子为30且色谱图的基线不是很稳定,但所获得的分离度和重复性还是满足条件的。
Simonson和Pietrzyk(1993)系统的检测了阴离子在用于间接光度法(IPD)中提高效率与
敏感性的分离缓冲液中的影响。最近,戴安公司的仪器制造者,Jensen和Hofler(1999)成
功地将阴离子交换色谱仪器用于肉产品、发酵液和果汁得PAD分析上。Casella等(2000)
对奶酪样本进行测定,发现绝对值5-10pmol的测定范围足够用于线性检测。Jandik等(2000)
提高了精氨酸在树脂上的沉积时间,测定了大豆水解产物。DeBruijn和Bout(2000)对甜
菜进行了测定,但必须去除大部分糖,因为糖会对测定产生干扰。Jandik等(2001)为了避
免这种干扰,采用氢离子形式的阳离子交换柱,从而在允许糖通过的情况下保留了氨基酸。
在8年多的发展时间后,阴离子交换色谱法还是没能在饲料分析行业中广泛接受。
很少研究者用RP-HPLC分离非衍生氨基酸。Saurina和Hernandez-Cassou(1994)详细
描述了运用离子对色谱的洗提系统,并于柱后衍生后在309nm,65℃时用
1,2-naphthochinone-4-sulphonate对氨基酸进行测定。这种方法适用于动物饲料和奶粉中氨基
酸的测定。Arlorio等(1998)还用离子对色谱法分析芳香族氨基酸、食品中维持生命所需
的胺以及奶酪中的高浓度氨基酸。紫外测定对这些氨基酸的灵敏性很高。最近发展起来的化
学发光氮检测仪可以对未衍生的氨基酸进行特异且敏感的度量(Fujinari等,1993;Bizanek
等,1996;Petritis等,2001)«Pei和Li(2000)介绍了专门测定氨基酸的安培感应器,这
种仪器利用固定的氨基酸氧化酶并用在HPLC上。
最近发展起来的在不同分离介质中测定氨基酸的毛细管电泳法(CE,毛细管区域电泳
(CZE),胶束动点毛细管色谱法(MECC))也得到了广泛的研究。在这种方法中,氨基酸
离子或衍生物在电场中通过毛细管迁移,涉及到多种技术。我们在此仅提及Smith(1997)
对这项技术的综述文章,近来有些研究利用CE分析了饲料和皮肤(Michaelsen等,1994)
或大豆蛋白中的氨基酸组成(Oguri等,1997)、啤酒(Klampfl等,1998)或酱油和饮料(Soga
和Ross,1999)中的游离氨基酸,以及人血浆中的蛋氨酸和同型半胱氨酸(Vecchione等,
1999)。
3.柱后衍生后的HPLC
在用非极性、紫外-可见光光度计或荧光活性试剂对氨基基团进行柱前衍生后,所有氨
基酸都可以由RP-HPLC分离出来。这对实验室来说很有利,因为实验室仅仅是偶尔测定氨
基酸,HPLC设备与氨基酸分析仪不同,它是多功能的。我们一直在研发新的衍生剂,且可
以被专利权保护,这对HPLC制造者很有利。实验技术主要在衍生条件(温度、时间、试
剂分离)、衍生稳定性和检测方法等方面有差别(参见表2.3)。目前还未找到理想的试剂,
近来的研究进展也没能替代己建立的老方法。
由PITC衍生的方法很早就建立起来,操作起来有些繁琐(反应时间长,需要在真空容
器内蒸储去除多余试剂)。Waters用特定设备进行Pico-Tag方法使这种衍生方法得以广泛的
商业化。形成的PITC氨基酸在酸性环境中非常稳定,可以在碱性环境中环化成乙内酰苯硫
HR(PTH)氨基酸(二次反应)。首次命名的衍生物通常在紫外光下进行色谱检测。样本经
过甲酸氧化后,所产生的磺基丙氨酸和蛋氨酸飒也可以经色谱法分离出来。
Cohen和Strydom(1988)以及Molnar-Perl(1994)对这一课题写过综述,Khalifa和
Molnar-Perl(1996)研究了水解产物中和过程产生的盐对衍生的影响,并未看到差别,所以
通常采用的通过蒸偏除盐酸的方法并不必要。Vasantis和Molnar-Perl(1999)系统地研究并
优化了27种氨基酸的分离条件。Elkin和Wasynczuk(1987)成功地将此技术应用在饲料原
材料和配合饲料上,并将其与IEC进行了比较。通常介绍的PITC方法与IEC是等价的。Zhao
等(1992)还对动物饲料和谷物进行了检测,报导了对高淀粉含量物质衍生的干扰作用。
Suzuki和Early(1993),Shang和Wang(1996)以及Gonzalez-Castro等(1997)报导了在
植物产品中进行的PITC氨基酸分析。Toran等(1996)对婴儿配方奶粉进行了研究,并对
含硫氨基酸的色谱测定条件进行了优化。另外,Alonso等(1994)对这些产品中的游离氨
基酸进行了测定,20分钟就可以对其定量,实验室内CM低于10%。其他研究者还用这项
技术分析了血浆以及其他生物样本中的游离氨基酸。(Hagen等,1993;Hariharan等,1993;
Bugueno等,1999;Campanella等,1999)。
OPA与硫醇的复合物产生的柱前衍生既具有快速的反应速度(室温下一分钟),又能用
于特定且灵敏的荧光检测。虽然次要氨基酸不参加反应,但是这可以通过在用OPA完全反
应后添加FMOC来避免这种现象,FMOC-脯氨酸的形成就是一个例子。OPA衍生的稳定性
非常有限,在测定赖氨酸时尤其如此。因此,OPA衍生最好是完全在自动取样器内实行自
动化测定。May和Brown(1989)、Molnar-Perl和Bozor(1998)Molnar-Perl和VasantisC1999)
以及Molnar-Perl(2001)系统地分析了不同硫醇、试剂混合物和衍生条件对氨基酸衍生物
产量和稳定性的影响。Butikofer等(1991,1992)对饲料、乳/谷物混合物和奶酪进行测定,
比较了OPA/FMOC柱前衍生和经典的离子交换色谱的精确性和重复性。根据他们的实验结
果,水解产物分析的重复性在各实验室间相似,但荧光检测对出赖氨酸以外的所有氨基酸的
检测灵敏度要高5-20倍。虽然环状试验得到的平均浓度几乎相同,但是对几乎所有氨基酸
(尤其是限制性蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸)而言,重复性明显要低。饲料样本的重复性最差,
作者解释是衍生过程中的基质产生了干扰作用。Puchala等(1994)用对牛瘤胃中的蛋氨酸
亚飒和其他氨基酸进行了测定。Li等(1998)用这种方法对饲料样本进行了测定,Heems
等(1998)对豆饼和饮料进行了测定,Zunin和Evangelisti(1999)测定了婴儿配方奶粉,
Baek等(1999)测定了酱油中的氨基酸和胺,Herbert等(2000)和Pripis-Nicolau等(2001)
分析了葡萄汁和葡萄酒中的游离氨基酸。其他研究者还测定了海产品中的游离氨基酸浓度
(Vazquesz-Ortiz等,1995;Antoine等,1999,2001)»这种方法还可以用于分析血浆和尿
液中的游离氨基酸的浓度(VanEijk等,1993;Begley等,1994;Fekkes等,1995,2000:
Czaudema和Kowalczuk,1998;Tcherkas等,2001)。
另一种用于柱前衍生的荧光试剂是FMOCo它可以在室温下与所有氨基酸快速反应,
但是比OPA要慢。得到的衍生物很稳定,且分析溶液可以在冰箱里保存几天。在有水的情
况下,9-笏甲醇从高荧光活性试剂中逐渐产生,并在氨基酸色谱途中央处洗提出来。因此,
我们需要一个提取步骤用到非极性试剂,如果不能在一个特定自动取样器内取样,这就会变
成一个不利条件。Cottingham和Smallidge(1988)使用这个技术测定全价料中的总赖氨酸
和预混料中的添加赖氨酸,取得了较好的结果。Femandez-Trapiella(1990)测定了豆粕、
肉粉、鱼粉和其他饲料原料中经过甲酸氧化后的蛋氨酸、胱氨酸和赖氨酸,获得了与通常使
用的IEC方法相等价的结果.不过,目前还没有将FMOC用于饲料分析的论文发表。
Kirschbaum等(1994a,b,c)用这种方法测定了氨基酸和胺,Arnold等(1994)对未成熟的
咖啡豆进行了分析,Or-Rashid等(2000)和Sultana等(2001)对瘤胃液中的游离氨基酸进
行了检测。也有对生物样本进行的试验(Ndibualonji等,1992;Ou等,1996;Or-Rashid等,
1999)»
1993年,Millipore公司推出了一种新的衍生试剂一一6-氨基喳咻基一N-羟基琥珀酰亚
氨基甲酸酯(AQC),他们用这种试剂和IEC两种方法同时分析饲料样本进行比较(Cohen和
DeAntonis,1994)。据这些研究的结果,高荧光活性的试剂可以与氨基酸快速反应,且较易
发生衍生反应,形成的衍生物在室温下可以稳定保存几周。研究者介绍了分离氧化水解产物
中磺基丙氨酸和蛋氨酸飒的HPLC条件,且试剂间互不干扰。Liu(1994)测定了添加到饲
料水解产物的14种氨基酸标准的还原情况,发现还原率在92-112%之间,平均为98%。相
比较而言,1EC除苏氨酸(85%)和精氨酸(117%)外,对其他氨基酸的还原率为93-110%。
Liu和其他研究者结束衍生步骤时,在反应区的封闭的自动取样器小瓶中于50-55℃对衍生
混合物加热10分钟。Liu等(1995)在食品和饲料样本中用这种方法进行检测,排除了中
性水解产物中盐的干扰作用。肉鸡饲料和玉米的色谱图表明氧化水解中所有氨基酸都较好的
分离开来。在几种样本中,用IEC也得到了一致的结果,包括对精氨酸和苏氨酸的检测。
Wendelen和Cohen(1997)研究了骨胶原水解产物和细胞培养介质中的氨基酸分离条件,
并设计了一套由四部分组成的优化洗提系统。Reverter等(1997)用这项技术对猪的血浆进
行了分析,但是用双梯度系统不能使所有血浆氨基酸完全分离。Miao等(2000)对不同饲
料所有氨基酸分析得到的还原率为88-110%o另一种广泛使用的衍生剂是二甲基氨基蔡磺酰
氯,在氨基酸和产物稳定的情况下需要在70℃保持12分钟来进行转化,着色后的衍生物用
光度计在436nm进行检测。Beckman公司的Schneider(1989)对这项技术的分离条件和重
复性进行了综述。Drnevich和Vary(1993)用这种方法对血浆样本进行了分析,Ikeda等(1993)
利用此试剂对骨胶原中的羟脯氨酸和脯氨酸进行了测定,并且Krause等测定了生物样本和
食品中的氨基酸和生物合成胺。
另外值得一提的是,Sanz等(1996)利用早已使用的、具荧光活性的二甲基氨基蔡磺
酰氯分析了乳和蛋中的蛋白质,还把它用于两个课题中,这两个课题分析了用气相色谱
(GC-MS)后,衍生为易挥发化合物的饲料和植物原材料中的氨基酸(Oh等,1995;
Muranszky,1996)»
(四)单一氨基酸的特殊测定
如果想要测定水解产物中的单一氨基酸或发酵溶液、果汁或提取物中这种游离形式氨基
酸的浓度,就可以不用色谱分离法,不过需要用到一种特异于此种氨基酸的试剂或酶。
Marko-Varga等(1993)报导了氨基酸的特定酶检测系统。Pohlmann等(1990)发明了一种
专门测定赖氨酸的酶流动注射方法,每小时可以检测30个样。Lavagnini等用相似的流动注
射分析法,对饲料水解产物中的赖氨酸浓度进行了测定,Chen等(1996)测定了鱼饲料中
的添加赖氨酸。Vrbova等(1992)介绍了能够用于测定小麦提取物中特异于L-赖氨酸的酶
电极。Hikuma等(1991)介绍了在使用L-赖氨酸氧化酶后的荧光检测法测定饲料水解产物
中的赖氨酸,这种方法在测定配合饲料、鱼粉和大豆时结果与IEC方法高度一致。Hsieh等
(1995)用荀三酮铁测定了培养肉汤中的赖氨酸.色氨酸的比色试验已在上文提到。
(五)有效/活性赖氨酸
蛋白质中的赖氨酸在热处理时易被破坏,而且还表现出糖的减少,这是因为它含有一个
活性L氨基基团。赖氨酸在参加过美拉德反应后,对动物或人的蛋白质合成就不再有效。
1960年,Carpenter介绍了体内测定有效且活性较高赖氨酸的实验方法,在这种方法中,蛋
白质用2,4-二硝基氟苯(FDNB)进行反应,产生的着色的二硝基苯①NP)-赖氨酸用水解后光
度法测定。理论上,只有L氨基基团具有活性的转化赖氨酸在动物蛋白质代谢中有用。还
有人介绍了其它试剂和测定条件,如用OPA或肌:基化转化为同型精氨酸(见下)。但是,
这种试验被许多问题困扰着,比如L氨基基团在样本蛋白质悬液中衍生的化学可进入性问
题,还有由基质产生的干扰和二次反应问题。因此,我们通常使用另一种更为复杂精密的
FDNB方法,在这种方法中,非衍生样本中的总赖氨酸和未转化赖氨酸在用FDNB反应并
水解后由色谱法进行测定。二者的有效赖氨酸有差别。Carpenter等(1989)将这些方法以
及体外测定鱼和肉中有效赖氨酸的另两个试验,和大鼠体内生长试验测定植物源性食品的有
效赖氨酸进行了比较;除了纯蛋白样本酪蛋白和大豆蛋白外,其他体外试验都失败了。Faldet
等(1991,1992)为了反刍动物对蛋白质的利用率达到最大,且获得赖氨酸利用的最佳条件,
而将之前提到的不同方法和大鼠生长试验应用在经不同条件热处理后的大豆样本上进行了
试验。最近的一些试验,多是利用HPLC测定以谷物为基础的婴儿食品、婴儿配方奶粉和
其它食品中的DNP-赖氨酸,但是并未用生物学实验对结果进行比较(Castillo等,1997;
Albala-Hurtado等,1997;Femandez-Artigas等,1999:Hermandez等,2001)。
Mauron和Bujard(1964)建立了一种可利用赖氨酸的分析方法,这种方法基于£-氨基在
碱性环境下。-甲基异胭胭基化形成同型精氨酸,经水解后同型精氨酸可以用IEC进行层析
测定。虽然这种蛋白质中的衍生现象仅在室温下可行,且需要几天的反应时间,但是它在今
天还被普遍应用。Mao等(1993)利用这种方法测定了经葡萄糖和碱处理后的大豆蛋白中
的有效赖氨酸,并将其结果与总赖氨酸分析试验进行了比较。他们的实验结果表明,虽然在
用葡萄糖处理后总赖氨酸下降了17-40%,但是有效赖氨酸含量却下降了78-85%。用脏基反
应证实热碱处理所引起的损害更为有效,因为在酸水解时一些被损害的赖氨酸(如美拉德反
应初始产生的果糖-赖氨酸)可以再除去。Imbeah等(1996)对酪蛋白和豆粕中的胭基化反
应条件进行了优化。他们在可溶奶蛋白中测得赖氨酸转化率为100%,而大豆中低于80%。
许多研究者,如Ravindran等(1996)在消化试验中对饲料原料进行胭基化,以此测定内源
氨基酸分泌量。后者主要研究棉籽蛋白中的最佳转化率,棉籽蛋白中有64%的赖氨酸转化
为同型精氨酸,同时还给出了其它饲料原料的赖氨酸转化率。Moughan和Rutherford(1996)
设计了最佳衍生条件,并在相一致的试验条件下,比较了用胭基反应法和FDNB法测定经
热处理后酪蛋白/乳糖混合物中活性赖氨酸的结果。此试验与后续研究(Rutherfurd和
Moughan,1997;Rutherfurd等,1997)旨在建立一个新的分析“可消化活性赖氨酸”生物
分析方法,这种方法对测定消化试验中赖氨酸消化率的准确性更高,因为它在分析原材料和
食糜中的赖氨酸食,不能除去蛋白质水解前被损坏的赖氨酸。还有些试验用OPA测定了蛋
白质、乳产品或奶中有效赖氨酸的含量(Vigo等,1992;Medina-Hernandez和Alvarez-Coque,
1992;Morales等,1996)。这种方法的有利之处在于荧光测定的快速性和简单性,因为并不
需要在此之前进行蛋白质水解。
比较饲料原料和饲料的不同方法中,体外方法较适宜且有效。这些试验中的相关影响有
一定意义,但是有关赖氨酸有效性的确定结果很大程度上受基质对测定系统的影响,且通常
与动物试验得到的结果有很大分歧。
(六)数据的准确性与精确性
定期进行的用于氨基酸分析的合作试验已经由不同组织开展了几年。如今,如果一个实
验室想要使其被公众认可,就必须保证试验结果的确定性。但是,合作试验试验的结果还未
公开出版。所有实验室都可以加入的组织包括每月都要进行环形试验的AAFCO(美国)以
及每进行四到八个样本测定的Bipea(法国)和KDLL(荷兰)。这些组织和其他不可轻易加
入的组织所得到的数据对氨基酸分析技术状态的说明比那些已出版的合作试验结果更为准
确,这些已出版的结果多数是重视方法的设计和标准化。表2.2对之前提到的一些文献上报
导的结果进行了总体的描述,多是采用国际AOAC组织和欧盟协会的官方方法。之前的蛋
白质氧化是含硫氨基酸总浓度分析准确性稍低的原因之一,蛋白质的氧化使得在样本制备过
程中产生了额外的变异;另一个原因是,含硫氨基酸在蛋白质中含量普遍偏低,其浓度仅
0.6-3%,因此峰值较低且峰值积分误差较高。而且,在IEC中,磺基丙氨酸通常以分离柱
的最大容积进行洗提,限制了基质对这个区域的干扰作用。由于抽提的简单化,对添加氨基
酸分析的重复力比测定总氨基酸要低。对2-5个因子来讲,实验室内重复力CM通常比实验
室间重复力CVR好,因为后者因其使用不同的设备、处理手段和标度而使随机误差不可避
免地有所提高。倘若实验室一直受环形测试和比对试验的监视,那么氨基酸分析的准确性和
精确性就有了保证。
三'饲料中氨基酸的近红外光谱分析
反射比技术中的近红外光谱(NIRS)是一种简化的分析方法,仅需要对样本进行研磨
并在NIRS设备中对饲料进行扫描。这种无害的测定方法不需要化学药品,且结果在几分钟
内就可以得到。自二十世纪七十年代早期,原材料和配合饲料的光谱范围就与粗成分各自的
浓度相关联,由湿化学进行分析,用化学统计相关性对一组样本建立了多元标准(Kramer,
1998及其引用专著)。在那时仅大学和研究院有可以进行此项工作的大型计算机。这种校正
应该包括至少50个样本,才能囊括多数样本类型,从而用于估计新样本的校正参数。
Rubenthaler和Bruinsma(1978)以及Gill等(1979)首先建立了小麦和大麦中氨基酸含量
的校正方法,几年后有了关于谷物和豌豆中氨基酸校正方法的论文(William等,1984,1985)。
但是,直到二十世纪九十年代,这项吸引人的测定技术才随着低成本、强大功能的个人电脑
的出现和可以使标准相互转化的软件的发明,而被包括饲料厂在内的公众广泛接受,并适应
了近红外分光光度计。Workman(1991)、Michalski和Mroczyk(1992)>Shenk(1994)、
Dyer和Feng(1996,1997)以及Pazdernik等(1997)还建立了分析豆粕和种子、谷物和油
菜籽中氨基酸的准确校正方法,从而在分析大范围原材料种类时,有一部分原料实现了NIRS
方法对花费较高的湿化学分析方法的替代。所有这些试验方法对氨基酸标准的使用都受到地
理和季节的限制。氨基酸生产厂家,Rhone-Poulenc(现在称Aventis)是第一家用消化率研
究中的原材料样本设计分析家禽可消化和总氨基酸浓度的公司,以此来为全世界消费者提供
服务。VanKempen和Jackson(1996)>VanKempen和Simmins(1997)、VanKempen和Bodin
(1998)以及Bodin等(1999)发表的论文中介绍了对所有主要饲料原材料中的必需氨基酸
进行分析得到的试验结果。工作的目的是提高日粮配制中的可消化氨基酸含量,这样使得原
材料的质量波动可以用NIRS分析出来,而不必仅仅依靠总结好的消化率数据。因为做消化
率试验花费太高,所以研究者因为缺乏足够的特征性原材料而被迫建立起从66个样本(包
括鱼粉、禽肉粉和肉骨粉)中得到的动物粉料分析标准以及仅以每种原料20—30个样本为
基础建立起豆粕、小麦和玉米的分析标准。合作试验并未对原材料变异的不完全范围和未知
分析误差给予定量,动物试验测得的消化率系数使得预测结果的可靠性有待商榷。德固萨专
门分析氨基酸的实验室旨在建立单一原材料中总氨基酸含量的标准。Fontaine等(2001,
2002)介绍了14种原材料的分析标准,大多包括100—330个样本,这些标准会定期更新。
在多数情况下,交叉检验的方差P远高于0.8,一部分原因是由于NIRS与湿化学之间具有
相关性。考虑到富含蛋白质饲料的必需氨基酸含量平均值标准,交叉检验的标准差(SECV)
仅2—5%。另外,大豆、肉骨粉和小麦各100个样本的分析标准用于确认分析NIRS氨基酸
的准确性。这些标准可以用于饲料厂内的设备上,德固萨每年都用这些标准分析5000多个
原材料样本。富有经验的专家建立的NIRS标准是一个使NIRS在饲料分析业广泛使用的有
效方法,第一次使单一原材料对时间要求严格的质量分析成为可能。
四、饲料中氨基酸分析的应用
(-)饲料配方的优化
如今对家禽和猪所有日粮的配制都力求适应各物种对氨基酸的需要,以满足最佳的生长
和饲料转化率。为了达到这个目的,营养学家必须有其所用原材料的氨基酸组成的可靠数据。
如果可以得到NIR氨基酸标准,那么通过添加氨基酸可以使所有质量波动得以校正。因为
这项技术操作复杂且消费较高,所以氨基酸的色谱分析通常不被饲料制造商所利用,但是他
们将在外部实验室中对自己的饲料原材料进行分析,从而发展其中期基质的数据。由国际组
织(CVB,2001;NRC,1998,2001)总结的许多原材料样本的氨基酸浓度得到的更新数
据也很有帮助。Fickler等(2001)已经编纂总结了120种原材料的有关氨基酸的15,000多
个文件,这些文件给出了原产国所提供的浓度以及讲解变化的信息。作者已经建立了多数原
材料的线性回归方程,从而可以用于分析粗蛋白样本中的氨基酸含量。
(-)可消化氨基酸的测定
专家几年前就开始以原材料的可消化氨基酸为基础对配合饲料的配制提出建议,尤其是
受热处理后富含蛋白质的原材料,如豆粕和菜籽粕、肉骨粉、禽副产品粉以及羽毛粉。我们
必须在复杂的动物试验中对每种物种进行独立的试验,通常需要去除肠道内食糜。因为对所
测原材料的消化率系数的计算把日粮氨基酸浓度与食糜和粪中未吸收的氨基酸联系起来,所
以提高分析的准确性和精确性就显得非常重要。因为分析的是不同的基质,所以用IEC和
柱后背三酮方法进行分析要优于柱前衍生后的HPLC方法。
(H)对配合饲料质量的检测
许多国家要求必须对商业动物饲料中的氨基酸含量给予注明,且由官方氨基酸分析方法
进行监督。但是对配合饲料和预混料中氨基酸组成的常规分析,即检测日粮配方和产量,也
是质量保证的一个必要工具。添加氨基酸结合入饲料的准确性和均匀性也具有重要的作用,
因为占据了总氨基酸含量的大部分比例,从而对动物生产性能的发挥具有重要的影响。这些
添加氨基酸的提取和分析的较好的重复性导致了混合试验可以测定混合样本中典型的十个
样本的浓度和变异度(CV)(Poole,1991;Fontaine,2002),几年内对分析方法的总结表
现出,大约五分之一饲料的方差高于10%,饲料中氨基酸的分布不具有足够的均匀性。
五'结论
1.现在对饲料中氨基酸分析的重要性比以往任何时候都重要,因为目前所有配合饲料都需
要由添加氨基酸配制而成,而且对原材料中氨基酸含量的充分认识可以节省大量成本。
2.离子交换色谱(IEC)和柱后荀三酮衍生对氨基酸的分析因其高精确性和对基质影响的耐
受性,而在最近几年成为官方的标准方法。水解条件也已经进行了标准化。这一经典技术的
应用比柱前衍生后的高效液相色谱(HPLC)分析的所有方法都要普遍。
3.测定饲料中的色氨酸时,在碱水解后不进行衍生化,在反相(RP-)硅胶上用HPLC进行
分离,并特异地用荧光检测进行度量。在自动取样器内用氢氧化钢水解得到了最佳的还原率。
4.氨基酸制造商的客服实验室建立的全球各种饲料原材料氨基酸分析的NIRS标准,及其在
饲料厂中首次转化成的分光光度法,使得日粮配方不断地适应目前原材料的批量生产。
参考文献
Albala-Hurtado,S.,Bover-Cid,S.,Izquierdo-Pulido,M.,Veciana-Nogues,M.T.andVidal-Carou,
M.C.(1997)Determinationofavailablelysineininfantmilkformulaebyhigh-performance
liquidchromatography.JournalofChromatographyA778,235-241.
Albin,D.M.,Wubben,J.E.andGabert,V.M.(2000a)Effectofhydrolysistimeonthe
determinationofaminoacidsinsamplesofsoybeanproductswithion-exchange
chromatographyorprecolumnderivatizationwithphenylisothiocyanate.Journalof
AgriculturalandFoodChemistry1684-1691.
Albin,D.M.,Wubben,J.E.andGabert,V.M.(2000b)Theinfluenceofhydrochloricacid
concentrationandmeasurementmethodonthedeterminationofaminoacidlevelsinsoya
beanproducts.AnimalFeedScienceandTechnology87,173-186.
Alegria,A.,Barbera,R.,Farre,R.,Ferreres,M.,Lagarda,M.J.andLopez,J.C.(1996)Isocratic
highperformanceliquidchromatographicdeterminationoftryptophanininfantformulas,
JournalofChromatographyA721,83-88.
Alonso,M.L.,Alvarez,A.I.andZapico,J.(1994)Rapidanalysisoffreeaminoacidsininfant
foods.JournalofLiquidChromatography17,4019-4030.
Amiss,T.J.,Tyczkowska,K.L.andAucoin,P.(1990)Analysisoftaurineinfelineplasmaand
wholebloodbyliquidchromatographywithfluorometricdetectionandconfirmationby
thermospraymassspectrometry.JournalofChromatography526,375-382.
Antoine,F.R.,Wei,C.L,Littell,R.C.andMarshall,M.R.(1999)HPLCmethodforanalysisof
free
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