农业部2122号公告-3-2014 转基因植物及其产品成分检测 报告基因GUS、GFP定性PCR方法

农业部2122号公告—3—2014转基因植物及其产品成分检测报告基因GUS、GFP定性PCR方法Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedp2014-07-07发布2014-08-01实施I农业部2122号公告—3—201412GUS-F:5'-CCGACGCGTCC5.18定性PCR反应试剂盒。3农业部2122号公告—3—2014按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013的规定执行。按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置3次平行。7.5.1.2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，混匀，再加25pL石蜡油(有热盖功能的PCR仪终浓度水10×PCR缓冲液dNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)10pmol/L下游引物总体积“—”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液。根据TaqDNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0pL。注：GUS基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别是GUS-F和GUS-R;GFP基因PCR下游引物分别是GFP-F和GFP-R;内标准基因PCR检测反应体系中，根据选择的内标准基因，选用合适的上下游引物。7.5.1.4进行PCR反应。反应程序为：94℃变性5min;94℃变性7.5.2对照PCR反应植物基因组相比的拷贝数分数为0.1%～1.0%的DNA溶液作为阳性对照；以水作为空白对照。7.6PCR产物电泳检测4农业部2122号公告—3—2014增片段是否为目的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。将回收的PCR产物克隆测序，与转基因植物中转入的GUS或GFP基因序列(参见附录A)进行比增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出报告基因，结果表述为“样品中未检测出5农业部2122号公告—3—20141AACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCT61AACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATA181ATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACA241GATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTA301GCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGG361ATCATCACCGAATACGGCGTGGATACGTTAGCCGGGCTGC421TGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTT1CAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC61TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGC121GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGA181AAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAA241GGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC301GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGC361TA