SNT 3729.2-2013 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第2部分杏成分检测 实时荧光PCR法_第1页
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第2部分：杏成分检测实时荧光PCR法I——第3部分：梨成分检测实时荧光PCR法；实时荧光PCR法；——第8部分：山楂成分检测实时荧光PCR法；——第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法；——第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第2部分。1的最低检出限(LOD)为1%(质量分数)。2ExTaqHS:高效热启动DNA聚合酶OD:光度密度(opticaldensity)5方法提要提取DNA,以DNA为模版，分别采用杏的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中杏成分的检测鉴定，其中以杏果肉DNA为阳性对照，以非杏来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物探针序列序列(5'-32)目的基因内参照5’端引物内参照3'端引物内参照探针AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCFAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-E18SrRNA基因FAM-CTCTCGGCAACGGATATCTCGG-ErRNA基因6.2CTAB提取缓冲液：20g/LCTA5,1.4mol/1.Nacl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa₂EDTA,pH8.0。6.4三氯甲烷(氯仿)。6.5异丙醇。6.670%乙醇(体积分数)。6.810×PCR缓冲液：氯化钾100mmol/L,硫酸铵160mmol/L,硫酸镁20mmol/L,Tris-HCl6.9ErTagHS聚合酶。6.10PremixExTaqTM(2×):ExTagHS聚合酶(终浓度0.1U/pL)、dNTP(终浓度0.6mmol/L)、Mg²+(终浓度6mmol/L)。7.1实时荧光PCR仪。7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。8.1DNA提取使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值Azo和Ago。c=A×N×50/1000上下游引物(10pmol/L)1探针(5pamol/L)1DNA模板(10pg/mL～100ag/mL)真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换杏引

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