SN∕T 3731.4-2017 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准代替SN/T3731.4—2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法I——第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法； 本部分为SN/T3731的第4部分。—-SN/T3731.4—21实时荧光PCR法2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测属雉科(Phasianidae)火鸡属(Meleagris),学名Meleagrisgallopavo。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCRPCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactiDNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonuleicdNTP:脱氧核苷酸三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiaminetetraa26.1检测用引物和探针序列(5'-3)目的基因火鸡12SrRNA基因6.2试剂6.2.3蛋白酶K溶液(20mg/mL)6.2.770%乙醇。6.2.8TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10mmol/ITris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA0.2mmol/L～0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。如果7.1实时荧光PCR仪。37.6研钵及粉碎装置。7.7涡旋振荡器8检验步骤8.1DNA提取将样品研磨后，称取200mg左右固体样品或200pl液体样都于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液和10pL蛋白酶K溶液。60℃振荡过夜后13000g离心10min,转移上清液到新的离心管中。加入750μL氯仿后用力振荡，13000g离心5min,将上清液转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min13000g离心Ismin,弃去上清液。加入350pLNaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min。转移上清液后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min,13000g离心10min,弃去上清液。加入500μL70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200pLTE溶液中。立即使用或-20℃保存备用。也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A2z6和Az₈。DNA的浓度按照式(1)计算，当Azoo/A比值在1/4~1.9之间时，适宜于PCR扩增：c=AXN×50/1000A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。8.3实时荧光PCR扩增8.3.2实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环。8.3.3每个样品设置两个平行的反应体系。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含火鸡成分的样品作阳性对照，用已知不含火鸡成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0;