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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法第6部分：龙眼I 第5部分：椴树： 第8部分：紫云英。本部分为SN/T4848的第6部分。1出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法第6部分：龙眼SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中龙眼成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于出口蜂蜜中龙眼成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.5%2规范性引用文件GB/T6682分析实验室用水规格GB14963—2011食品安全国家标准蜂蜜GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonule2UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)BHQ1:黑洞猝灭基团1(Blackholeq引物/探针序列(5'→3')长度靶基因内参照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGA龙眼P:FAM-CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTA36.4体积分数为70%的乙醇。8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中；加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下8.1.1.8加入0.8倍体积的异丙醇混匀，-20℃放置0.548.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4℃离心10min。8.1.2蜂蜜上清DNA提取将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL,参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放8.2DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A₂go和A₂80。DNA的浓度按照式(1)计算：c——DNA浓度，单位为微克每微升(pg/pL);A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。8.3实时荧光PCR扩增8.3.1实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系的反应条件见表2。内参照DNA模板(10ng/μL～200ng/μL)无菌ddH₂O8.3.2实时荧光PCR反应程序内参照基因：50℃2min;95℃预变性10min;95℃15s,60℃1min,40个循环。龙眼FSDlb基因：50℃2min;95℃预变性10min;95℃15s,60℃1min,50个循环。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>50.0。b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>50.0。5c)45<Ct值<50,则重复实验一次。再次扩增后Ct值<50,则判定为阳性；Ct值≥50,则判定为6CCCAAGCTTCCTGATTGGGTAAGTTAGCTTCATTGAAAGAAAGTTATCCATTACCCTTTAATCTTTTTTAATTTTTCAGAAGC沉淀溶液

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