HPLC-MSMS法测定化妆品中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1

摘要建立高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定化妆品中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法。化妆品经70%甲醇提取并经免疫亲和柱净化，采用C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm），流动相体系为2.0mmol/L乙酸铵甲醇溶液（含0.1%甲酸）和2.0mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），流速为0.3mL/min进行梯度洗脱，扫描方式为正离子多反应监测模式（MRM）。黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1线性关系均良好，相关系数不低于0.998。检出限范围为0.028～0.078ng/g。精密度及稳定性均良好，回收率85.0%～96.2%。该方法准确、高效，为化妆品中黄曲霉毒素的测定提供了技术支持。引言黄曲霉毒素（AFT）是致癌性极强的一类霉菌毒素，它们种类繁多、结构不一，目前最常见的有黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1，它们有极强的致癌和致突变特性，能够造成人体的肝、胆、肾、脾等内脏组织损伤。黄曲霉毒素主要存在于谷物及产品、坚果和香料类产品中，特别容易在大豆、花生等农产品中产生，而这些农产品是重要的植物油脂来源。作为一类常用的化妆品基础原料，植物油脂的作用非常大。植物油脂可以在皮肤表面形成一层憎水性薄膜，尤其是当气温下降时，憎水性薄膜可以减少皮肤表面水分蒸发，同时软化角质层，使之恢复弹性，因此广泛应用于各类化妆品中。同时，植物油脂也是一类良好的活性物质载体，在承载活性成分时，可使一些活性成分刺激性降低、功效增强。用于化妆品的原料植物油脂主要有棕榈油、橄榄油、霍霍巴油等，但近年来因市场降低成本的要求，其他常见植物油脂也开始应用于化妆品中。霉菌毒素污染是植物油脂存在的重要安全隐患，已成为威胁植物油脂安全的主要问题之一。若油基类化妆品所用原料油脂被黄曲霉毒素污染，则可能造成此类化妆品中含有黄曲霉毒素。据报道，从8种不同类型的化妆品中检测出多种黄曲霉毒素，它们能经皮肤吸收，严重危害人们的身心健康。然而，目前对于化妆品中黄曲霉毒素的检测仍为空白，因此，亟需建立选择性好、灵敏度高的检测方法，用于化妆品中黄曲霉毒素的检测。黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1结构类似，母核均为二氢呋喃香豆素，各分子结构如下图所示，区别仅在于A环是否为不饱和环、E环为五元环或六元环。目前用于检测黄曲霉毒素的方法主要有ELISA法（酶联免疫法）、TLC法（薄层色谱法）、HPLC法以及LC-MS/MS法等。由于化妆品基质复杂，传统净化方式很难做到干扰成分的去除。免疫亲和柱法（IAC）是一种新兴的免疫色谱技术，它选用特异性结合的抗原抗体，根据其可逆结合特性提取目标化合物，有很好的净化效果。本文将免疫亲和净化柱法、高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法（HPLC-MS/MS）结合，通过前处理及色谱-质谱条件的不断优化，建立了能够高选择性测定化妆品中的黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法，为化妆品的风险监测和后期监督抽验提供了科学的检验方法依据。

正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与材料1.2

溶液制备1.2.1

标准系列溶液配制精密量取黄曲霉毒素总量（G2、G1、B2、B1）混合对照品溶液适量，用甲醇稀释成一系列浓度的混合对照品工作液，具体浓度见表1。1.2.2

样品溶液制备准确称取约2.5g混合均匀的化妆品样品，置于50mL离心管中，加入20mL70%甲醇，涡旋3min混匀，室温下超声提取15～20min，6000r/min离心10min，移取4mL上清液，加入20mL含1%吐温-20的PBS溶液并混匀，然后将其全部转移到免疫亲和柱上，待样液流尽后，分别用10mL水洗涤免疫亲和柱两次。1.3

色谱和质谱条件液相色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm×100mm,1.7μm）；流动相：A：2.0mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B：2.0mmol/L乙酸铵甲醇（含0.1%甲酸）；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL。梯度洗脱程序见表2。2

结果与讨论2.1

线性范围、检出限与定量限将4种黄曲霉毒素混合标准系列溶液进样，以4种黄曲霉毒素混合标准系列溶液浓度为横坐标，定量离子色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归。4种黄曲霉毒素的线性范围、线性回归方程和相关系数见表4。2.2

日内及日间精密度将黄曲霉毒素混合标准溶液重复进样6次，以6次测定峰面积考察方法的日内精密度，RSD范围为2.11%～2.63%；在相同实验条件下连续6天进样，考察方法的日间精密度，RSD范围为1.78%～2.13%，具体结果见表5，该结果表明所建方法精密度良好。2.3

稳定性将黄曲霉毒素混合标准溶液按上述实验方法分别在0、2、4、8、16、24、48h进行测定，以测定浓度值计算的RSD，考察4种黄曲霉毒素的稳定性。RSD分别为0.96%、2.34%、2.16%、1.41%，说明该方法测定化妆品中4种黄曲霉毒素在48h内稳定。2.4

回收率向空白化妆品样品（某品牌卸妆油）中添加高、中、低3种不同浓度水平的混合标准溶液，每个浓度水平各平行制备3份，按所建立的方法进行测定，进行回收率试验，回收率结果见表6。从结果看，该方法的回收率范围为85.0%～96.2%，RSD范围为1.2%～4.0%，均能够满足化妆品中4种黄曲霉毒素准确测定的要求。2.5

结果讨论大部分黄曲霉毒素为极性化合物，而油脂类化合物极性均较小，根据相似相溶原理，甲醇-水可以完全溶解黄曲霉毒素，且对不同剂型的化妆品基质分散性较好，经济、安全，故选用甲醇-水作为提取溶剂。3

结论结论化妆品直接作用于人体表面，在满足人们“爱美之心”的同时，其质量也关系到人民群众身体健康。本实验建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定化妆品中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法，精密度及稳定性均良好，回收率较高，可以准确、高效地检测化妆品中黄