临床基因扩增检验质量保证+课件

临床基因扩增检验的

质量保证卫生部临床检验中心National

Center

For

Clinical

Laboratories●为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。质量保证(QualityAssurance,QA)卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratories室内质量控制

(InternalQuality

Control,IQC)的概念●由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，

连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的

—项工作。●

可概括为：(1)执行者：实验室技术人员；(2)

目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：

决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien室间质量评价

(ExternalQualityAssessment,EQA)●

为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机

构

，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，

发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA

用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实

验室能力验证

(Proficiency

testing,PT)。在以前的文献

中

，EQA

常描述室间质量控制。卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien批(Run)●

在相同条件下所获得的一组测定。卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories●

正态分布(Gaussian

distribution)

当一

质控物用同一方法在不同的时间重复多

次测定，当测定数据足够多时，如以横

轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中

相应测定值的个数，则可得到一个两头

低，中间高，中为所有测定值的均值，

左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分

布，又称高斯分布。定

义卫生部临床检验中心NationalCenter

ForClinical

Laboratories正态分布的基本统计学含义可用均数(X)

、

标

准差

(s)和概率来说明。()X-3S

X+25

x-S

X

X+s

X+3S●

标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。●

实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗

价值。●

报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。临床基因扩增检验实验室常规测定步骤卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories质量保证、室内质控和室间质评之间的关系患者图1

.

临床检马验中涉及的各-

步骤及其与质量控制的关系QAEQA标

本

接

收测

定

的

有

效

性

i临

床

诊

疗

价

值贴上特定的实马验室标签

测

定备

测

来保

择者本本结果发

出

结

果

解

释

临

床

管

理标

本

收

实

验

室辕晷

解释定

集存选患标标项

目IQC集●标本收集●标本保存●标本运送临床标本收集、运送、保存及其质量控制卫生部临床检验中心National

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Laboratories标本收集

●标本采集时间对扩增检测结果的影响●

标本采集部位的准备●标本的类型和采集量●

采样质量的评价●采样及运输容器●

标本采集中的防污染卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories●在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。标本采集时间对扩增检测结果的影响卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories●血液标本采集●分泌物标本：采集部位的清洁消毒

可去掉污染的微生物或其它杂物，

但应适度，过度清洁消毒有可能会

去掉或破坏靶微生物，故标本采集

部位的准备应由训练有素的人员

进行。标本采集部位的准备卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratorien标本的类型和采集量●标本的类型：血清(浆)、分泌物、痰、

粪便、尿和脑脊液等。●

标本的采集量：应根据所测病原体而定。

一般来说，如果标本的量对病原体培

养够用的话，则其量亦足以用于核酸

提取及其后的扩增检测。●对于定量测定来说，对标本的收集要卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratorien求更为精确。●分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，

所需类型细胞的数量和核酸总量。评价方法：包括肉眼观察，显微镜下观察

和化学分析等。采样质量的评价●血清(浆)标本：溶血、脂血等；卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories采样及运输容器●标本的采集材料如棉签应为一次性使

用；●采样及运输容器应为密闭的一次性无

菌装置；●采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试

剂材料不应对核酸扩增及检测过程造卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratorien成干扰。●采集中要特别注意污染，防止混入

操作者的头发、表皮细胞、痰液等；●如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，

以使可能存在的RNase

失活。标本采集中的防污染卫生部临床检验中心NationalCenter

ForClinical

Laboratorien标本保存●靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶

的作用而迅速降解，因此标本的

保存对于核酸扩增测定的有效性

极为重要。●使用GITC作为稳定剂保存标本，

标本可在室温下稳定约7天。卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratorien标本保存

●

临床体液标本长期保存应在-70℃下。●

如为提取核酸后用于DNA

扩增分析的样

本，可于10mmol/L

Tris,1mmol/LEDTA(pH7.5～8.0)

缓冲液中4

℃下保存。●用于RNA

扩增分析的样本，则应于上述

缓冲液中-80℃或液氮下保存。●核酸的乙醇沉淀物则可于-20℃下保存。卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories标本运送●样本一经采集，则应尽可能快的送至检

测实验室。●

样本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用

于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室

温下运送或邮寄。●

实验室应根据待测靶核酸的特性，对各

种临床样本的运送条件作出相应的规定。卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories临床基因扩增检验的室内质量控制

●测定前的质量控制●核酸样本的制备及其质量控制●统计学质量控制●质量控制的评价卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories测定前质量控制●实验室设施、仪器设备及管理●理想的试剂和操作方法●人员培训卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories●临床基因扩增检验实验室应有充分合理

的空间、良好的照明和空调设备；●实验室仪器设备应保养良好，实验用品

要达到相应的要求。加样器的校准?

带

滤塞吸头的使用及质检?离心机?热循

环仪?水浴箱和/或恒温干浴仪?酶标仪和洗板机?卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratorien实验室设施、仪器设备及管理

产

物

分

析区空气流向扩增区空气流向标

本

制

备区空气流向试

剂

准

备区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向理想的核酸扩增实验室设计A

卫生部临床检验中心National

CenterForClinical

Laboratorien产

物

分

析区空气流向扩增区空气流向标

本

制

备区空气流向试

剂

准

备区空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向理想的核酸扩增实验室设计B卫生部临床检验中心National

CenterForClinical

Laboratorien“十六字口诀”卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratories●

各区独立●

注意风向●

因地制宜●

方便工作核酸扩增检测实验室设计的一般原则扩增区门产物分析区门扩

增

及

产

物分析区门外走廊

门标本制备区

试剂准备区门门

外走廊

门卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratorien标本制备区门试剂准备区AB门标本制备区空气流向

门扩

增

及

产物分析区空气流向门空气流向试剂准备区门卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratorien扩增和产物分析区空气流向其他实验室试剂准备区空气流向其他实验室

其他实验室走廊走廊其他实验室空气流向标本制备区其他实验室其他实验室其他实验室卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien其他实验室走廊其他实验室卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories标本制备区空气流向+

门扩

增

及

产物分析区空气流向++门空气流向试剂准备区门空气流向

走廊空气流向+

其他实验室标

本

制

备区物势积音空气流向++其他实验室其他实验室其他实验室试剂准备区空气流向其他实验室门缓冲间

缓冲间工作流向卫生部临床检验中心National

Center

For

Clinical

Laboratorien产物分析区扩增区传递窗空气流向空气流向缓冲间专用走廊标本制备区试剂准备区传递窗

传递窗空气流向空气流向“无基因”或

“无核酸”概念的重要性卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien失控标准实验失败如靶温度或温度差异超出允许范围待测孔未出现扩增，检测温度打印程序不对不符合要求不符合要求不符合要求卫生部临床检验中心质控方法仪器校验实验热电偶监测温度扩增功能检测程序打印校准温度检测预防性维护及校准频

度当仪器移动时每月一次每4个月一次每次测定时

每年2次每次实验每年2次基因扩增仪器设备的质控加样器水浴箱酶标仪仪器设备扩增仪NationalCenterForClinicalLaboratories带滤芯吸头的使用及质检●首先制备一个含1～2%甘油及色素(如甲基橙)的水溶液，如果吸头

的最大体积为100

μl,则将加样器吸

取体积调至110～120

μl,

再套上吸

头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●离心管PCR

抑制物质检●其他核酸提取用离心管质检卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories●一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录

仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温

度变异超出1℃时，其可测出来。●具体做法是将装有TE

缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管

放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插

至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加

热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温

度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同

孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增扩增仪孔间温度的重复性和均一性

的检测方法卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories周期。扩增仪孔间温度的重复性和均一性

的检测方法●第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过

扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有

一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反

应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，

观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个

孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否

会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明

相应孔的热传导有损坏。卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratories●试剂盒的质检●定量测定的精密度是测定组成步骤的变

异和的平方根(SD)=√

SD²+SD²+SD²+

…

…上式中SDa

、SD₆

、SD.是步骤a

、b

、c

等

(例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等)的标准差理想的试剂和操作方法卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien理想的试剂和操作方法●改善测定精密度的措施必须首先

着重在最不精密的步骤上，应对

试剂准备、标本收集、核酸提取、

测定方法和仪器操作写出“标准

操作程序”(SOP)卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratorien●

质量手册●

质量体系程序文件●

标准操作程序(SOP)

(相关记录表格、报告

)文件内容按确定的质量方针和目标以及

适用的相关认可标准描述质量体

系描述为实施质量体系要素所涉

及到的各职能部门的活动详细的技术作业文件所量手册(辰次A)质量体系程序程序文件(E

次BD标准岗作程序，记录表格，很告節(E

次C)实验室质量管理体系的建立卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories●SOP

:

形式，缺乏可操作性●记录：检查型。多而杂。●质控：形式或没有●分析：缺乏。卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories存在问题实验室质量管理的内涵●写你所应做的●做你所写的●记录你已做的●分析你已做的卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories把解上作商单的事做野就是不简单把每一件半凡的事做好就是不平凡A#A

序汪中求若细节Derailis

thekey

of

succerr决定成败新华出版社●看得见的●看不见的卫生部临床检验中心National

Center

For

Clinical

Laboratories卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratorien卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratorien●思维习惯与行为习惯●罗马不是一天建成的(Romewas

not

built

ina

day)●

好习惯是生产力●习惯即命运卫生部临床检验中心National

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Clinical

Laboratories质量体系文件的三大特性●法规性、唯一性和适用性。●法规性：是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真

执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规

定的程序进行。●唯一性：则是指(1)一个实验室只能有一个质量体系文件

系统；(2)一项检验活动只能有唯一的操作程序；(3)一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；(4)只能使

用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能

使用。●适用性：是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎

么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有

文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。

当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。

National

Center

For

Cliien心nicalLaborat部临床检验SOP

等于试剂盒说明书吗?卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratoriesXXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第

页

共

页编写人审核人批准人一目的：二适用范围：三职责或责任人：四(方法原理)五

(

检测设备和试剂)六(所需的环境条件)七操作步骤：1.2.3.五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告怎样编写SOP?National

Center

ForTC生lin部iclao验ratri心en●

谁来做(Who):

责任人●

做什么(

What):适用范围●

何时

(When):

适用范围●

何地

(Where):

适用范围●

为什么做

(Why):

目的●

如何做

(How):

操作步骤SOP(5W

和1H)卫生部临床检验中心National

Center

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Clinical

Laboratories聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR

反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个

PCR

进程，最

后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量

PCR反应中，引入了一种

荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使用TaqMan荧光探针的

检测原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核

苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的

荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq

酶的5'-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报

告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA

链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加【图1】0这样就可以通过荧光强度

变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。Ttritten

b制人Date日期：20100120Effective

Date生效日期：Distribution

Scope发放范国：Gene

Lab临床基固扩培实验室Reviewed

by审核者：Approved

b批准人Dooment

Anmually

Raviewing文件年度审核Reviewed

by审核者：Reviemed

b审核者：Ravieved

b审核者：Date日期Date日期Data日期Reviered

by审核者：Reviewed

by审核者：Feviewed

by审核者：Date日期Date日期Date日期tPotynotsution2.stranddmpbusmana40Assay项目名称English英文HBVDNAChinese中文乙型肝炎病毒核酸Me

thod方法聚合酶链反应Basis

for

method方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》第3版(2006年)第七篇第六章第一节二乙型肝炎病毒(HBV)DNAPCR(ABI7300)检测标准操作程序1.INFORMATION

FOR

TFSI检测信息卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien2.AHALYTICALPRINCIPIE检

测

原

理图14.Polymongohon

complotedR·Rupoder

9-Ouenchm荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意

位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为

CT

值(thresholdvalue)

。CT

值与起始模板的关系研究表明，每个模板的

CT

值与该模板的起始拷贝数的对

数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT

值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准

曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表

Ct值。因此，只要获得未知样品的

Ct一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断

产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR的终产物量与起始模板

量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR

产物量不能计算出起始

DNA

拷贝数。只有在荧

光信号指数扩增阶段，

PCR

产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这

个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量

PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和

CT值【图2】。图2值基线o3101卫生部临床检验中心rClinicalLaboratorien样本Cr20循环数无模板对照5

ao值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数【图三】。Rn+△AnAn-

40045Iypes类型Suggested

types推荐类型血清Preferred

types可接受类型EDTA或枸橼酸钠抗凝血浆Volume样本量0ptimum最佳量1.0

mlMinimum最少量200

ulCollection

Containers收集容器含促凝胶试管或普通试管(不含其它物质)Transport

containers运输容器带盖试管Transport

requirenents运输要求在室温条件下运送(可接受冷冻及冷藏样本)Stability

&Storage

Requirements

稳定性及储藏要求Room

temperature

室温8小时Refriger

atedtemperatumre冷藏温度(2-8T)3

天-20℃2星期-70℃长期Timing

Considerations时间要求无Unacceptable

Specimens.Actions

to

Take样本拒收及采取措施拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆Compromising

Physical

Characteristies

/

Interfering

Factors影响/干扰因素溶血或脂血标本可能会严重影响实验结果0ther

Considerations其它条件应避免反复冻融标本3.1

Patient

Preparation病人准备事项Component准备事顶Details具体内容Fasting/Special

Diets禁食/特种次食不要求禁食，但由于明显的脂浊可干扰反应，所以空腹

标本较为理想Patient

Preparation病人的准备事项无Special

Collection

Procedures

样本采集特殊要求避免溶血，抗凝血标本6小时内分离血浆，不抗凝血标

本2小时内分离血清卫生部临床检验中心ClinicalLaboratorien3.2SpecimenType&Handling样本类型及处理方法3.SPECDMENREQUIREMENIS样

本

要

求4.REAGENIS

试

剂Manufacturers

生产广家艾康生物技术(杭州)有限公司Approval

Number

批准文号国药准字20060017Outline

of

Product

试剂想要Type类型Starage

and

Stability

诸藏及稳定性Preparetions

准备工作核酸提取液1.8

ml×1-20℃

6个月室温平衡20minHBV强阳性对照品100

ul×1-20℃

6个月室温平衡20minHBV临界阳性对照品100

ul×1-20℃

6个月室温平衡20min阴性对照品100

ul×1-20℃

6个月室温平衡20minHBV定量标准品20

ul×1-20℃

6个月室温平衡20minAttention注意事项：开启所有试剂盒(包括校准品、标准品)均需注明开启日期及开启人(除该试剂盒一次性全部用完)。每个试剂盒都应贴有下列标签：物质名称、批号、特殊储藏说明，开启人，开

启日期，开启后有效期。开启时应检查试剂是否存在变色，是否有肉眼可见的细菌生长迹象、

浊度、沉淀反应等，如有则表示该试剂已经变质或超过保质期需要废弃。5.EQUIPHENI仪器设备Name名称Storage

and

Stability

储藏及稳定性Preparetions准备工作HEV

DN阳性

室内质控品-20=℃

6个月室温平衡20min,使用前需2000rpm离心数秒HBVDNA阴性

对照品-20=C

6个月室温平衡20min,使用前需2000rpm离心数秒6.2Frequency质控周期每检测一批次标本均需同时检测至少一个浓度水平的阳性质控品、阴性对照品、临界阳也

对照品及只含反应混合液的空白对照。6.3CoefficientofVariation

CV变异系数EQUIPMENT使用的仪器设备Name名称Specifications型号Calibration

methods校准方式实时荧光PCR仪ABI

7300送校备注：“校准方式”栏填写送校、自校、检定、比对等。6.QUALITYCONTRDL

质里控制6.1

ControlsUsed质控品卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien不同浓度的质控品对应的最大允许变异系数详见下表。质控品浓度范围1.0-9.0E+03IU/ml最大允许变异系数5.56%7.2Frequency定标周期每一批次标本均需同时检测4个标准品。7.3

Procedure程序分别在相应的反应管加入4个梯度的标准品(无需进行核酸提取过程),同病人标本一起上

机扩增分析。7.4Correctiveactionforunacceptablecalibration定标失败处理

应采取以下步骤，但不仅限于此：7.4.1

检查扩增程序设置是否正确。7.4.2检查试剂和标准品是否过期，如已过期，则替换。7.4.3检查标准品反应管中是否含有反应混合液。7.4.4核实仪器的计划维修是否均按时进行，如否，则执行仪器保养程序。7.4.5重新定标。1.0-9.0E+04IU/1

4.1751.0-9.0E+05IU/r3.3351.0-9.0E+06u/t

2.781.0-9.0E+07Iu/z2.3816.4AnalyticMethod分析方法6.4.1阳性质控品及阴性对照品室温静置复融20min后，和样本同样检测。6.4.2将阳性质控品检测结果取以10为底的对数值输入LIS的质控系统中，系统自动作图分析6.4Judgerulesofunacceptablecontrol失控判断规则详见SOP-PCR005-G《临床基因扩增实验室室内质控标准操作程序》6.5Correctiveactionforunacceptablecontrol失控处理详见SOP-PCR005-G《临床基因扩增实验室室内质控标准操作程序》7.CalibrationProcedure定标7.1Standards标准品Name名称Type类型Traceability瓶原方式Storage

andStability储藏及稳定性Preparetion

准备工作HBV

DNA定量

标准品20

ul/管溯源于国家技术监督局批准的GBW(E)090031所提供的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)血清标准物质-20℃

6个月室温平衡20min,使

用前振荡混匀数秒

并2000rpm离心数

秒卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien8.PRDCEDURE操作步骤8.1试剂配制8.1.1进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒【图4】。查看外包装盒(包括生产批号、有效

期),无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq

酶(核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)【图5】,不一致则不可使用，需

更换新的试剂。室温平衡20min,完全融化后2000rpm离心备用。8.1.2核酸提取液的分装a.取0

.

5ml

离心管架置于超净工作台内(开机前用紫外线消毒30分钟),用右手拿起镊子逐个将离心管放入

离心管架(注意应夹住离心管外壁，

不能碰到管内壁),摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，

离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品)。完成后将镊子放回原位【图6】。b.用移液器准确吸取核酸提取液

50ul分装至0.5ml离心管中(左上角

第一排开始，从左往右依次加入)。因

核酸提取液内含固体沉淀颗粒物，为

使颗粒均匀分布，故每次取样时都要

用移液器反复吸打3-4次【图7】。分卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien从左往右摆隔行排列图6夹住

管

懸

外

部管盖朝前c.

加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺序为：从右下角第一个开始，从右往左依次盖上【图8】。离心管盖全部盖完后，通过传递窗转移至标本处理区。8.1.3HBV-DNA反应液的配制每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照(如同时检测低值阳性质控品，则无需再检测临界阳性对照)、阳性质控品、阳

性标准品。所需每批需配制数

n=样本数+对照品+阳性标准品+质控品，每个测试反应体系配

制如下表a.

每盒HBV-DNA

试剂可检测32人份，根据每日需检测标本份数计算出每批所需HBV

FCR反应液和Taq酶用量(例：有111人份需要进行检测，则有3盒试剂可直接使用10ul

移液器将Taq

酶加入HBV

PCR反应液中，另有111-3*32=15人份试剂需将

HBV

PCR反应液和Taq

酶使用移液器按反应体系比例吸取至1.5ml离心管中配制【图9】)。b.取出离心后备用的HBV

PCR反应液和Taq

酶，按上述要求配制后用旋涡振荡器振荡混匀5-10sec,然后再用离心机2000rpm离心10sec备

用试村HBV

FCR反应液Taq酶用量(ul)35.70.3生部临床检验中心inicalLaboratorien装完毕后将移液器量程归位。【图10]。e.从操作台面上拿取

HBV-DNA试剂配制盒(可选用空余的200ul

枪头盒)至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按顺序编号【图11】0编号规则为：样本扩增反应管对应的孔位按相应的样本流水号编写、阳性质控品反应管对应的孔位编“Q”如有高值则标为H,低值为L),阴性对照品孔位编“-”,临界阳性对照对应的孔位编“±”,空白对照对应的孔位编“B”,1

号标准品对应的孔位编“S1”,2

号标准品对应的孔位编“S2”,依此类推。d.编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管(ABI7300

使用的是八联-薄壁反应管，镊子应夹住反应管外壁，不可接到内壁【图12】)e.

按【图13】所示方向依次将所有反应管(反应管数=n)

隔列摆放到配For卫生部临床检验中心ClinicalLaboratorien置盒上。【图13】8.1.3.7从离心机中取出已混好Taq

酶的PCR反应液，用移液器(量程调

至36ul),

准确吸取反应液并按从上

到下、从左至右的顺序依次加至反应

管中，注意：吸头应深入到反应管底

部，放液时应缓慢，切勿形成气泡。

【图14】。8.1.3.8全部加样完毕后将配制盒通过传递窗转移至样本处理区。

8.2标本处理8.2.1标本、质控品及对照品的处理8.2.1.1从冰箱冷冻室取出

HBVDNA阳性质控品阴性对照品室温平衡20min待其完全融化。8.2.1.2核对标本和原始申请单的条形码和检验项目，无误后依次粘贴上相应的流水号，如质控及对照8.2.1.3从传递窗中取出试剂准备区分装好核酸提取液的离心管架，移至生物安全柜内在管盖上用记号笔写上阿拉伯数字1、2、3……,阳性质控管标

隔行排列上“Q”

如有高值则标为H,低值为L),

图

15阴性对照管标上“-”,临界阳性对照管标上“±”。离心管盖上标记的是1,就表示该管要加入流水号为P0001的标本【图15】。注意：每个离心管的编号方向都应朝向

管口开启的方向。【图16】卫生部临床检验中心Clinical

Laboratories8.2.1.4去除标本管盖：将标本从前处理取至标本准备区，按排列顺序依次去除样本管上的橡胶塞。具体操作为：在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指捏紧橡胶塞，右手食指轻轻顶住橡胶塞顶部凹面，逆时针方向轻轻旋下橡胶塞后废弃于装有消毒液的垃圾桶(图17】注意：手指切勿接触到血清管口或碰触到血清，如手套上有血清则需及时跟换新的手套；待所b.

吸样完毕后，将样本管放至另一试管架中(切勿不可将样本放回原试管架位)【图19]。图10c.

再用左手按8.2.1.3所述样本流图20新位置原位置发力方向固定管体8.2.1.5样本及对照品的处理：a.左手拿起样本，用量程为200ul调至50ul

的移液器准确吸取样本

(注：为保证样本的均一性和吸样准

确，每次取样时需用移液器将样本吸

打3-5次；吸样时移液器套筒不可接角触到样本管内壁)【图18】吸打样本3-5次套筒不可接触

样本管内壁图18卫生部临床检验中心For

Clinical

Laboratories有样本管盖都去除完毕后，也需更换新的手套。)e.

加样完毕后弃枪头于盛有消毒液的垃圾桶中(注：一个吸头只能用于

一个样本的吸样，禁止使用一个吸头

重复吸取不同样本)。同时盖上离心

管盖并放回离心管架(放回的位置需

另起一行，切不可放回原位),继续处理下一个样本。对照品和质控品同病人样本一样处理。【图22】f.

待一架离心管全部加样完成后用

振荡混匀器充分振荡混匀10-15秒。g.

左手将混匀后的离心管转移至恒

温金属浴上(注：离心管需对称的放

置在恒温金属浴相匹配的孔槽内),用计时器计时，100℃(误差不超过±1℃)干浴10min(误差不超过±30sec)。【图23】水号和离心管编号的对应关系拿起相应的离心管，打开离心管盖(注：单手操作，食指和中指固定离心管，拇指稍向后上方发力打开管盖，手指切勿碰到离心管口和管盖内侧)【图20】。d.

管盖完全打开后，用左手食指、拇指和中指固定离心管，将吸头中的样本

全部打入离心管底部，轻轻吸打混匀

3-5次。【图21】卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien加热孔与离心管体积相匹配温度显示图23i.将上述离心管按顺序对称放入低温高速离心机转子孔内，摆放离心管时要将离心管开口朝内，盖上转子盖及离心机盖后，12,000rpm

离心10mino(注：离心时需在转子孔内放置0.5ml离心管专用适配器X

图26】。j.待离心结束后，取出离心管并按编号顺序依次摆放在离心管架上(参照【

图15】的排列方式)并4℃冰箱保存备用；若当天不使用，则应保存在-20℃条件下，使用前置室温平衡

20min,

再以12,000rpm离心10minoh.十分钟后(前后不超过半分钟),右手用镊子夹起橡皮垫从恒温金属

浴中拿出离心管【图25】干浴时用离心管架置于加热的离心管上，防止离心管盖因加热爆开导致标本间的污染【图24】卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien图27b.核对取样的离心管上编号与加样的反应管编号是否一致，并将上清液全部打入反应液中，切勿打到反应管壁上。【图28】8.2.2加样操作(在实验台上操作)8.2.2.1用量程为10ul(先将吸样量调至4ul)的移液器依次将样品、对照品、质控品提取后的上清液及HBV

标准品各4ul加到对应的反应管中。a.准确吸样，吸头浸入上清液的深度≤1mm,注意不要碰到沉淀，移液

器套筒不可碰到离心管盖和管壁(标

准品应先用移液器吸打3-5次以混

匀)【图27】d.盖上离心管盖并放回离心管架(放回的位置为另一行，不可放回原位)【图29】核对编号

是否-

致图28c.

每加一个样本后将吸头废弃于盛有消毒液的垃圾桶中，并更换新的吸

头处理下一样本。卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien套筒不可磁

管盖、管堆吸头浸入深度≤1mm待加样

标本已加样标本对照品、质控品

标准品图298.2.2.3将反应管连同试剂配置盒通过传递窗传至扩增分析区。8.3扩增分析8.3.1打开扩增仪专用电脑，待电脑完全启动进入操

作界面后再开启定量PCR仪主机电源。a.按压托盘以打开它【图31】b.

将反应管按顺序纵向放置放入反应板架(注：在反应管总数不足96个时，应对称的将反应管放置在反应板袈上，两边放置要求尽可能对称，可以防止热盖下压时发生倾斜，也可以使各反应管受力和受热都比较均匀)【图32】。c.按压托盘以关闭它。8.2.2.2待全部样本加样完毕更换手套，左手用镊子夹起反应管盖的一

侧的延伸段(不要碰到管盖),然后

用右手大拇指从左往右依次盖紧管

盖(不要碰到其他未盖的反应管口)

【如图30]。从前往后从左往右卫生部临床检验中心Clinical

Laboratorien图30b.

单击“新建”,软件自动弹出“Newdocument

wizard”窗口，

A31ay

栏选择“

StandardCurve(Absolute

Quantitation)”,

Cortane

栏选择“96-Well

Clear”,

AunMoo栏接

受默认的”Standard7300”

。再

点

击Browse

选择反应程序。【图34】c.点

击

Brawse.

进

入

Templatar文件夹，选择并双击预先已经按试剂

说明书编好扩增程序的“ACONHBV.sdt”反应板文件【

图35】,

回

到“New

document

wizard”窗口，点击

Firith

进入样本编辑界面。

【图35】8.3.2扩增程序编辑a.在电脑桌面上找到ABI7300运行程序，

鼠标左键双击进入【图33】卫生部临床检验中心Clinical

LaboratorienAUNHPpostmg白c7区mn10028白

-DeAxpMb输入保存名称

选择保存类型则扩增位置的编号=样本流水号=样本提取时的离心管号=反应管载体

的

编

号

=

1

,

依

此

类

推

；②阴性对照为-③临界阳性对照为+-④质控品为Q(高值为H,低值为L)⑤四个标准品为S1

、S2

、S3

、S4

(

左

键双击S1弹出WellInspector窗口，

选

中

4

个

标

准

品

并

在Task选项中选e.编辑完成后，单击

按钮，弹跳出SaveAs窗口，在Fe

name.栏填

写该批次标本检测的唯一名称(如2009-01-

16第一批样本检测名称就Save酵type

编

辑

为20090116HBV-1),

栏选择

SDS

Docupentg广adsl

最后单击Save

保

存。【图37】择Standard,并在Quantity中填上相对应的标准品数值)⑥空白对照为Bo【图36】卫生部临床检验中心ClinicalLaboratoriesd.根据仪器上反应管放置的位置在软件中对应的孔位上编号，编号规则如下：四

国

四质控及对照编号

国

面样本编号国有目

自ADICON

P0001①样本流水号是国59t⁰ro2009-01-16行口4to006目

;及36准号白目目貌日四m自b.

条件设定单

击

Ampfication

Plot

窗口。①

选择

6

Manua

Baselne

调节模式，Stat

[oyclo}

选

择

6

,

End(cyde}

选择15(也可根据仪器实

际情况，两者在2-15之间变化);②

阈值设定原则以阈值线刚好超

过正常阴性对照品的最高点并进入

指数扩增期(可手工上下拖动阈值线

)

,设定好后单击

Anabve

【图40】。图40步骤循环数温度时间1137℃2min2195℃5min34094℃20sec60sec①核对扩增程序是否与试剂说明书完全一致②核对反应体积是否正确；③核对荧光信号采集时间是否与试

剂说明书一致。扩增程序具体设置如下：反应体积为40ul,荧光信号采集时间为“62℃60sec”程序处。e.核对无误后，单击

Slat

二开始运行程序，整个程序运行时间约为1小时40分钟。sDSv¹.4Therunwsstoopedbytheuser,图39

oK8.3.3结果分析a.扩增程序运行结束后，软件出现提示窗口，单击OK。

【图39】卫生部临床检验中心ClinicalLaboratoriesYnstentf.

单

击

编辑窗口【图38】:进入扩增程序62℃以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。其中任何一项未达到要求，须

查找原因，分析该批结果是否可靠，必要时重新检测。b.将原始结果打印，按编号对应关系将所有样本的结果输入LIS系统，同时该打印件作为原

记录保存归档。9.CAICULATIONS结

果

计

算本项目不涉及此条款。10.Repeat

Criteria

and

Resulting复查标准及结果报告10.1Judgmentoftheresult结果审核a.检测样本中1.000E+03IU/ml≤HBVDNA≤1.000E+08IU/ml,测定结果有效，可直接c.单

击LStandardCurve

选项，要求①

斜率在-3.0~-4.0之间。②

截距>40③

相关系数R²>0.99满足上述三点说明本次标准曲线符

合要求【图41】。8.3.4结果分析a.

单

击

Resutts

选项，再选择

Plate

选项，则显示该批次所有样本检测的结果(以科学计数法方式显示)【图42】①

空白对照及阴性对照无扩增，若

检测了试剂盒自带临界阳性对照，则

其CT值≤35;②

阳性质控品结果在控；③

标准曲线符合要求；0300Syicns⁰SSo1Wve

T0007UNWr

dracm0Weefootkkunrt

aros

Wns*b口

酒

回

回

国

口

施

警beoYinshrumemYResnkePuY(EpedaYcamp0nemYpopnc1onPatY

p1!4国

2002

102

1Q四

1

f

e

+

0

0

2

四15se+00s1四22+0o四un当国hdt0

100634+0020s0。00日42四3624+002eUhon图42国四1aei因540e-002四neIU/ml时，定量结果小于试剂的检测下限，报告为<1.000E+03卫生部临床检验中心ClinicalLaboratories报告。b.样本检测结果<1.000E+03

IU/ml。c.检测样本

HBVDNA为

Undet

IU/ml时，报告为<1.000E+03

IU/ml。d.

样本检测结果>1.000E+08IU/ml时，则应用HBV

DNA阴性血清将样本进行100-1000倍稀释后再重新进行检测，并将结果乘以稀释倍数后报告结果。e.其他注意事项详见

S0P-PCR027-G《临床基因扩增实验室报告审核标准操作程序》的相关

要求。10.2

Reference

Ranges参考范围<1.000E+03IU/ml10.3AMR分析测量范围1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+08IU/ml10.4

Clinic

Reportable

Range临床可报告范围1.000E+03IU/ml≤HBV

DNA≤1.000E+11IU/ml10.5RepeatCriteria复查标准详见

S0P-PCRO27-G《临床基因扩增实验室报告审核标准操作程序》和

S0P-LAB014-G《实

验室检验结果复查的标准操作程序》中的相关要求。11.CLNICAL.SIGNIFICANCE临床意义11.1判断疾病的严重程度和传染性，HBVDNA是直接反映HBV夏制状态及传染性的最佳指标。

11.2PCR结果与血清免疫学结果的综合评价随着现代医学的检测技术的发展，采用基因

扩增技术(PCR)

检测对HBV-DNA进行乙肝病毒DNA定性和定量，结合二对半检测结果，对

于机体乙肝病毒感染状态尤变异株发生和病人预后的评估更为科学。11.3观察抗病毒药物疗效，指导药物用量直接检测血清中的HBVDNA是监控HBV传染和

观察抗病毒药物疗效的最可靠的方法。根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》中国慢

性乙型肝炎病人治疗的目的主要就是降低血清HBV

DNA,诱

导HBeAg血清转换，使LT

正常化，改善肝脏组织学病变，改善疾病症状、体征，提高生活质量，降低肝硬化和肝癌的发生

率。同时血清的

HBVDNA

滴度的动态变化还可在临床上对用药的剂量、用药时间以及是否需

要联合用药等提供参考。11.4献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断

HBsAg在血清中的检出通常在乙肝病毒感染机体后的2-4月出现，平均为56天左右。而HBVDNA的检出可以将该所谓“窗口期”提前6-15天，对于早期诊断和提高输血安全有着重要的意义。11.5预测病情、判断预后

HBV

DNA的定量检出对于病情的预测和预后的判断有着参考意

义。通常HBVDNA持续阳性超过6个月的会转为慢性肝炎。抗-HBe阳性患者血清HBVDNA卫生部临床检验中心ClinicalLaboratories持续阳性常提示肝损严重。50%以上抗-HBe阳性慢活肝病人，经平均4.5年发展为肝硬化，常与HBVDNA持续阳性有关。11.6器官移植中的作用肝脏器官移植是目前肝硬化晚期治疗的唯一方法，但有约86%以上

既往

HBsAg携带者术后HBsAg重新出现。检测HBVDNA可用于观察免疫受损患者的HBV

感染

状况。肝移植后乙肝主要是复发，再感染为次要因素。特别是移植前HBV复制水平高者，复

发和再感染的机率是要更高的。定量检测HBV

DNA为肝移植术后的跟踪观测具有较好的临床

价值。11.7对阻断母婴传播的监测联合应用高价免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻断母婴传播，但

仍有5-10×婴儿对疫苗呈低反应，荧光PCR

可对此进行监测，分析阻断失败的原因。12.LIMITATIONSOFMETHDD方

法

限

制12.1InterferingSubstances干扰物质12.1.1严重溶血。12.1.2肝素抗凝。12.

1.3脂浊12.2Sensitivity

and

specificity灵敏度和特异性

检测下限1.000E+03IU/ml13.SAFETY

安全须知13.1S0P-LAB010-G《实验室消毒标准操作程序》13.2SU0004-G《检验工作人员安全防护制度》13.3SU0006-G《意外事故处理制度》14.References

相关文件14.1

EF3002-G《实时荧光PCR技术》14.2EF0012-G《全国临床检验操作规程-第三版》14.3SOF-PCR005-字母代码《基因实验室室内质控标准操作程序》14.4S0P-LAB014-G《实验室检验结果复查的标准操作程序》14.5S0F-PCR027-G《临床基因扩增实验室报告审核标准操作程序》15.Records

相关记录15.1

SOF-PCR011-01-G《PCR实验室检验记录表》15.2

S0P-PCR201-01-G《核酸提取编号记录表》卫生部临床检验中心ClinicalLaboratorien实验记录表格的设计卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories●表格种类繁多●重复记录●表格无实用性，用于检查的痕迹很重存在问题卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories仪器名称购买日期仪器编号维护要求维护日期维护内容维护人员校准要求校准日期校

准

内

容操作人签名日期开机时间运行状态关机时间内

容记录者备

注2345678910111213141516171819202122232425262728293031卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories仪器使用记录表仪器名称：

年

月仪器设备维护和校准记录表4本

记

录

保

存

期

5

年本

记

录

保

存

期

5

年编号测定日

期类别(省或卫生部)专业组上报截

止日期上传日

期质控测定

人签名质控上传

人签名备注1234567891011121314151617181920日

期试剂区标本处理区扩增检测区执行人12345678910111213141516171819202122232425262728293031卫工

可pu

四

TT

心NationalCenterForClinical

Laboratories室间质评记录表年年

月注：消毒时间必须30-60分钟，消毒结束后必须打

√签字。紫外消毒车消毒记录表注：质评结果按卫生部或省临检中心的要求需另附本记

录

保

存

期

5

年本

记

录

保

存

期

5

年日期度

亡度记录者篇名备庄11410铺12023编号日

期拒

收

原

因送检人

签

字接收人签

字备

注1234567891011121314151617181920卫生部临床检验中心NationalCenterForClinical

Laboratorien

记

者

期

A

实验空环境温湿度记录表拒收标本记录表年

月请选择1.gt试

2.C件.矿检向n本

记

录

保

存

期

5

年记录表格设计的基本原则●

信息充分●简单明了融入LIS系统?卫生部临床检验中心NationalCenterForClinicalLaboratories●临床标本的检测信息能有机联系起来实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内

生物安全柜的滤膜在使用有效期内

消毒溶液在有效期内洗眼器内无菌生理盐水在有效期内

离心管、带滤芯吸头已经过质检合格操作者：临床PCR检验流程记录表检验日期