发酵工艺 课件 项目二 发酵培养基的制备及优化

项目二

发酵培养基的制备及优化发酵工艺项目二发酵培养基的制备及优化一、发酵培养基的要求及配制原则二、发酵培养基的成分、组成及来源三、发酵培养基的类型、设计及优化四、淀粉水解糖的制备一、发酵培养基的要求及配制原则

（一）发酵培养基的要求1、能够满足发酵生产菌种的生长、代谢需要2、能够保证生产菌种生长、代谢迅速3、目标代谢产物的产量、得率最高4、减少代谢副产物生成5、有利于产物的提取及纯化一、发酵培养基的要求及配制原则

（一）发酵培养基的要求6、原料成本低并具有稳定的质量7、原料来源广泛且供应充足8、有利于发酵过程的溶解氧及搅拌9、废物的综合利用性强，且容易处理（二）发酵培养基的配制原则

微生物生长繁殖均需要培养基中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养素，但不同微生物对营养物质的具体需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。1、选择适宜的营养物质（二）发酵培养基的配制原则培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时，不能满足微生物正常生长所需；浓度过高时，也可能对微生物生长起抑制作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。在设计培养基时，还应特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。2、营养物质浓度及配比合适（二）发酵培养基的配制原则培养基的pH必须控制在一定范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖、合成产物的最适pH也各不相同。一般来讲，细菌与放线菌适合在pH6.5~7.5范围内生长；酵母菌和霉菌适合在pH5.0~6.0范围内生长。

因此，为了在微生物生长繁殖和合成产物的过程中保持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂。3、控制pH条件（二）发酵培养基的配制原则配制培养基时应尽量利用成本低且易于获得的原料作为培养基组分。特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。

大量的农副产品及其制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。4、原料来源的选择（二）发酵培养基的配制原则要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此要对所用器具及生产场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更要进行严格的灭菌。一般可以采取高压蒸汽灭菌法进行培养基灭菌，通常在121℃、103.4kpa条件下维持15-30min可达到灭菌目的。某些在加热灭菌中易分解、挥发或者易形成沉淀的物质通常先进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合。5、灭菌处理二、发酵培养基的成分、组成及来源

（一）碳源凡是能够提供微生物细胞物质和代谢产物中碳素来源的营养物质称为碳源。它是组成培养基的主要成分之一，主要功能有两个：一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；二是提供菌体合成目标产物的原料。在各类碳源中，糖类是微生物利用最好、应用最广泛的一类，如葡萄糖、糖蜜和淀粉等；其次是醇类、有机酸类和脂类等。1、纯糖原料葡萄糖是碳源中最易被利用的糖，它是由淀粉加工制备的，其产品有固体粉状葡萄糖和葡萄糖浆（含有少量的双糖）。工业发酵中使用的蔗糖和乳糖既有纯制品，又有含此两种糖的糖蜜和乳清，麦芽糖多用于制糖浆。2、淀粉水解糖大多数的微生物都不能直接利用淀粉，在氨基酸、抗生素、有机酸的生产中，都要求将淀粉进行糖化，制成淀粉水解糖使用。淀粉水解常用的有酸解法、酶解法、酸酶结合法。（一）碳源3、糖蜜糖蜜是一种非结晶糖分，因其本身就含有相当数量的可发酵性糖，是微生物工业大规模发酵生产酒精、甘油、丙酮、丁醇、柠檬酸、谷氨酸、食用酵母及液态饲料等的良好原料。糖蜜可分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。4、纤维素原料纤维素是自然界最丰富的可再生资源，每年通过光合作用合成1×1012t以上，这是世界粮食产量的几百倍，开发纤维素代粮发酵的前景广阔。（一）碳源5、其他碳源乙醇、甘露醇和甘油可作为微生物的碳源和能源。除乙酸已用作微生物的培养基外，其他有机酸比糖类较难被微生物吸收，作为碳源的效果不如糖类。脂类物质更难被微生物作为碳源利用，但并不是不能利用，低浓度的高级脂肪酸还可刺激某些细菌的生长。少数自养型微生物以CO2或碳酸盐作为唯一或主要的碳源。（一）碳源1、有机氮源常用的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟等。机氮源营养丰富，因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速等特点。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体。（二）氮源2、无机氮源常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等，微生物对它们的吸收利用一般较快，但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源称为生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。（二）氮源（三）无机盐及微量元素无机盐和微量元素是指除碳、氮元素外其他各种重要元素及其供体。它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分，维持生物大分子和细胞结构的稳定性，调节并维持细胞的渗透压平衡，控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。无机盐和微量元素根据微生物对其需求量的大小不同，有大量元素和微量元素之分。除了合成培养基外，一般在天然培养基中不再另外单独加入无机盐和微量元素。（四）生长因子从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等，均称为生长因子。从狭义上讲，仅指维生素。生长因子主要功能维生素B1脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基维生素B2黄素蛋白的辅基、与氢的转移有关维生素B6辅基，与氨基酸的脱羧、转氨基有关生物素各种羧化酶的辅基维生素B12钴酰胺的辅酶，与甲硫氪酸和胸腺嘧啶棱苷酸的合成和异构化有关叶酸辅酶F，与核酸的合成有关泛酸乙酰载体的辅基，与酰基转移有关维生素K电子传递表2-3常见生长因子的主要功能1、前体前体是指加入发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。大多数前体（如苯乙酸）对微生物的生长有毒性，在生产中为了减少毒性和增加前体的利用率，通常采用少量多次的流加工艺。2、产物合成促进剂所谓产物合成促进剂，是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显著提高发酵产量的物质。它们常以添加剂的形式加入发酵培养基中。（五）前体和产物促进剂（六）水水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。对于发酵工厂来说，洁净、恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。（七）消泡剂消泡剂的作用是消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌。常用的种类包括植物油脂、动物油脂和一些化学合成的高分子化合物。三、发酵培养基的类型、设计及优化

（一）发酵培养基的类型1、根据组成成分不同分类（1）天然培养基（2）合成培养基（3）半合成培养基（一）发酵培养基的类型2、根据物理状态不同分类（1）固体培养基凝固培养基非可逆性凝固培养基天然固体培养基滤膜（2）半固体培养基（3）液体培养基（一）发酵培养基的类型3、根据用途不同分类（1）实验室常用培养基基础培养基加富培养基鉴别培养基选择培养基（2）发酵生产常用培养基孢子培养基种子培养基发酵培养基（二）发酵培养基的设计及优化一般培养基设计要经过以下几个步骤：根据前人的经验和培养要求，初步确定可能的培养基组分用量。通过单因子实验最终确定最为适合的培养基组分。当确定培养基成分后，再以统计学方法确定各成分最适合的浓度。（二）发酵培养基的设计及优化1、单因子实验单因子实验是传统的有效方法，适用于培养基组成和单一营养成分的选择。在确认培养基基本组成之后，逐个改变某一种营养成分的品种或浓度进行实验，分析比较实验所得的菌种生长情况、碳氮代谢规律、pH值变化情况、产物合成速率等结果，从中确定应采用的原材料品种或配比浓度。（二）发酵培养基的设计及优化2、正交实验设计正交实验设计是根据正交性准则来选择有代表性的实验点，这些实验点具备“均匀分散，整齐可比”的特点，有效地解决了实验因素较多而产生的多因素完全实施方案过大的矛盾，具体实验实施时采用规格化的正交表来安排多因素实验，并对实验结果进行统计分析，找出最优实验方案，广泛应用于科学研究和工农业生产中。（二）发酵培养基的设计及优化3、均匀设计均匀设计和正交实验设计相比，只考虑实验点在实验范围内“均匀分散”，而不要求“整齐可比”，也是通过一套精心设计的均匀设计表来进行实验设计。均匀设计实验结果的统计分析一般采用非线性的二次响应曲面回归分析，可考察各因素的重要程度和因素间的交互作用。（二）发酵培养基的设计及优化4、响应面分析Plackett-Burman（PB）实验设计法：主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著性而采用的实验设计方法，可以分清实验因素对指标影响的大小，找出主要因素，抓住主要矛盾。最陡爬坡试验：根据Plackett-Burman（PB）实验设计找出显著因素后，安排最陡爬坡试验，要先逼近最佳区域后再建立有效的响应面拟合方程。Box-BenhnkenDesign（BBD）法：采用多元二次方程来拟合因素和响应面值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优提取条件，解决多变量问题的一种统计学方法。四、淀粉水解糖的制备

发酵工业中大多数生产菌种都不能直接利用或只能利用极少量的淀粉、糊精为碳源。因此，在发酵生产之前，必须将淀粉质原料水解为葡萄糖，才能供发酵使用。

目前，由淀粉经水解制备葡萄糖（或葡萄糖液）广泛应用于发酵工业中的谷氨酸发酵、氨基酸发酵、抗生素发酵和葡萄糖生产等方面。在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，制得的水解糖液叫淀粉糖。（一）淀粉水解的理论基础1、淀粉的糊化和液化

淀粉的糊化：淀粉颗粒在受热过程中吸水膨胀，体积迅速增大，晶体结构被破坏，颗粒外膜裂开，形成黏稠的液体，这个过程称为糊化。淀粉的液化：糊化的淀粉在酶的作用下，淀粉分子链被切断、分子量变小、黏度迅速降低的过程称为液化。液化的关键就是液化酶的应用，液化酶即α-淀粉酶。2、淀粉的糖化经过液化以后的淀粉液，加入一定量的糖化酶，使溶解状态的淀粉变为可发酵的糖类，这种利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转变为葡萄糖的过程称为糖化。葡萄糖聚合度与碘液呈色最高吸收波长/nm葡萄糖聚合度与碘液呈色最高吸收波长/nm7-8无色48041蓝紫色60016淡红色51061蓝色62021红色540120蓝色63028红紫色560330蓝色

34紫色580

表2-4葡萄糖聚合度与碘液的呈色表2、淀粉的糖化（1）双酶水解法制葡萄糖的优点酶解的反应条件比较温和微生物作用的专一性强，水解副反应少，水解糖液纯度高可在较高淀粉浓度下水解，酶解法中淀粉含量为34%-40%，而且可采用粗原料由于菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制（2）双酶水解法制葡萄糖的缺点酶解反应时间较长（从投料到糖化完毕需2-3d）、使用的设备较多、需具备专门培养酶的条件，且由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。（二）淀粉的液化方法与设备液化分类方法很多，以水解动力不同可分为酸法、酸酶法、酶法及机械液化法；以生产工艺不同可分为间歇式、半连续式和连续式；以设备不同可分为管式、罐式、喷射式；以加酶方式不同可分为一次加酶、二次加酶、三次加酶液化法；以酶制剂耐温性不同可分为中温酶法、高温酶法、中温酶与高温酶混合法；以原料精粗不同可分为淀粉质原料直接液化法与精制淀粉液化法等。每一种方法又可分为几小类方法，并且各分类方法又存在交叉现象。（二）淀