毕业设计（论文）-板蓝根多糖提取

淮阴工学院毕业设计说明书（论文）第1页共19页1,引言板蓝根（常用别名：靛青根、蓝靛根、大青根）是一种中药材。中国各地均产。板蓝根分为北板蓝根和南板蓝根，北板蓝根来源为十字花科植物菘蓝（IsatistinctoriaL.）和草大青（I.indigoticaFort.）的根；南板蓝根为爵床科植物马蓝（BaphicacanthuscusiaBrem.）的根茎及根。具有清热解毒、凉血消肿、利咽之功效。在临床上用于预防病毒性感冒和治疗腮腺炎[1]。据报道，板蓝根多糖具有多种生物活性，对特异性免疫和非特异性免疫均有一定的促进作用，是一种比较理想的免疫增强剂[2-3]。在中国由于抗生素滥用，细菌整体的耐药率，要远远高于欧美国家约45%左右。合理的使用中药将有效减少抗生素的滥用。板蓝根是抗病毒中药的典型代表，在中国有两千多年的应用历史，临床效果良好，而体外抗病毒筛选也基本证实其确切疗效，首个获美国国立卫生研究院资助的中药研究项目。1.1多糖的提取方法多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物、和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。多糖是板蓝根的主要活性物质之一[4-6]。目前，多糖较常用的提取方法有：水提法、超声辅助提取法和酶提取法等。1.1.1水提法用水作溶剂来提取多糖是最常用的方法之一，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多糖多数是中性多糖。一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。如李宏燕等人用100g去核枣粉，加入250mL适当体积分数的乙醇，45℃水浴回流脱脂两次，离心分离后枣渣加水共3500mL，90℃水浴搅拌浸提8h，离心分离，合并所得多糖提取液；提取液45℃减压浓缩，浓缩液用无水乙醇沉淀，离心分离，得粗多糖沉淀；粗多糖加水溶解后，氯仿、正丁醇脱蛋白，用NaOH溶液调节pH值至弱碱性，加0.4倍多糖液体积的H202，40℃水浴保温4h脱色；脱色液对蒸馏水透析24h，无水乙醇沉淀，离心分离，45℃真空干燥，得到大枣多糖。溶剂提取为常用的传统方法之一，有自身的优点。如不需特殊设备，成本低等，但此法往往提取效率低且费时，操作周期过长。因此，近年来，伴随着现代工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应用到植物多糖的提取中。1.1.2超声提取法超声波作为一种先进的提取方法，具有提取时间短、能耗低、效率高等特点，在生产中得到了广泛的应用。其主要原理就是超声波产生“空化作用”，这种空化作用能够产生局部的高温高压，并形成强大的冲击波或高速射流，这种强大的高速射流能够有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率。同时，高速射流对植物细胞组织产生一种物理剪切力，使之变形、破裂并释放出内含物，这就大大加速了萃取过程。另外，超声波的许多次级效应如热效应、溶化、扩散、击碎、化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速多糖成分在溶剂中的扩散释放，促进多糖与溶剂混合，有利于萃取。1.1.3酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件下分解植物组织，加速有效成分的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的产物。此法可使后续的浓缩和脱蛋白工艺更简易、省时，粗多糖的纯度更高。但会提高生产成本，对提取条件要求较高。杨云采用的单酶法和复合酶法提取大枣多糖，单酶法提取多糖含量最高可达44.69%，而复合酶法多糖最高含量可达68.13%。1.2多糖含量的测定本次试验采用苯酚—硫酸比色法测定板蓝根多糖的含量。苯酚—硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等［7］提出的。其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处和一定浓度范围内，其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系[8]，从而可用比色法测定其含量。本课题拟用超声波辅助提取法来分离提取板蓝根中的多糖，研究板蓝根多糖的提取工艺以及板蓝根多糖在体外的抑菌活性。2材料与方法2.1实验材料2.1.1实验仪器表1实验仪器仪器名称规格生产厂家数量超声波清洗器KQ-250B昆山市超声仪器有限公司1台离心机DL-6000B上海安亭科学仪器厂1台数显恒温水浴锅HHS2江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司1台紫外分光光度计UV-2000尤尼柯（上海）仪器有限公司1台分析天平FA2004上海恒平科技有限公司1台立式压力蒸汽灭菌器LDZX-30FB上海申安医疗器械厂1台电热恒温鼓风干燥箱PHG-9123A上海精宏实验设备有限公司1台智能型生化培养箱SPX-260A上海特成机械设备有限公司1台2.1.2实验试剂表2实验试剂药品名化学式规格级别生产厂家氯化钠NaClAR天津市密欧化学试剂有限公司无水乙醇C2H5OHAR吴江仁和化工有限公司氢氧化钠NaOHAR蚌埠化学试剂厂甲醇CH3OHAR宜兴市第二化学试剂厂苯酚C6H6OAR无锡市恒奥物贸有限公司硫酸H2SO4AR国药集团化学试剂有限公司2.2实验方法2.2.1板蓝根多糖提取的工艺流程板蓝根粉末→干燥→回流脱脂→80%乙醇浸提→超声波辅助提取→离心取上清液→浓缩→乙醇沉淀→水溶→冷冻干燥→板蓝根多糖2.2.2样品的前处理将从中药店购买的板蓝根，粉碎成粒径约40目的粉末，置于65℃烘箱中烘干至恒重。采用索氏抽提法，用乙醚作为萃取溶剂，对板蓝根粉进行脱脂处理。准确称取干燥板蓝根粉末4g，装入滤纸包中，封好包口。用长镊子将装有板蓝根粉末的滤纸包放入抽提筒中，连接好抽提器各部分，向提取管中加入无水乙醚，使其正好虹吸一次，再向提取管中加入石油醚，使液面达到第一次的70%位置，接通冷凝水水流，调节水温至70—80℃，使冷凝下滴的乙醚成连珠状（120～150滴/min或回流7次/h以上），回流5小时取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发。用80%乙醇浸提除去料粉中的单糖、多酚、低聚糖和苷类等小分子杂质，将料粉晾干。2.2.3提取工艺的确定2.2.3.1标准曲线的绘制本实验采用苯酚—硫酸比色法测定多糖的含量。以葡萄糖为标准品制作标准曲线，精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100mg于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，制得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL于100mL容量瓶中定容。分别吸取1mL于5支编号试管中，加入5%苯酚溶液1mL摇匀。匀速加入5mL浓硫酸，立即摇匀后置于冷水浴冷却至室温。分别移取0.5mL于5支编号的50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度[9]。以蒸馏水同法处理，作为空白参比，于紫外分光光度计在490nm下测定吸光度，记录数值，绘制葡萄糖的标准曲线。2.2.3.2超声波辅助提取的单因素实验通过文献的查阅，影响多糖提取率的因素主要有料水比、超声提取功率、超声提取时间和提取温度这四个因素。由于设备条件限制，实验室中KQ-250B型超声波清洗机功率不可调，所以本实验分别以超声波提取时间、提取温度和料水比为实验因素，多糖提取率为指标进行单因素实验。(1)超声波提取时间准确称取料粉2.0g，分别放于5支50mL离心管中，调节超级恒温水浴锅使超声波清洗机中的水温恒定在60℃，控制料水比为1:25，分别进行超声辅助提取10min、20min、30min、40min以及50min，将提取液以2000rpm离心15min，收集上清液，再按照同样的超声提取条件重复提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍体积的无水乙醇，静置24h析出多糖，以2000rpm的转速离心15min获得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷冻干燥即得到板蓝根粗多糖。称取一定量的粗多糖，加水定容，用苯酚—硫酸比色法测定多糖的含量，并计算提取率。用绘图软件绘制超声提取时间与多糖提取率的关系曲线。(2)提取温度准确称取料粉2.0g，分别放于5支50mL离心管中，控制料水比为1:25，提取时间为40min，通过调节超级恒温水浴锅使提取过程分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下进行。将提取液以2000rpm离心15min，收集上清液，再按照同样的超声提取条件重复提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍体积的无水乙醇，静置24h析出多糖，以2000rpm的转速离心15min获得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷冻干燥即得到板蓝根粗多糖。称取一定量的粗多糖，加水定容，测定多糖的含量，并计算提取率。用绘图软件绘制提取温度与多糖提取率的关系曲线。(3)料水比确称取料粉2.0g，分别放于4支50mL离心管中，再准确称取1.0g料粉分装于2支50mL离心管中。调节超级恒温水浴锅使超声波清洗机中的水温恒定在60℃，设置超声波提取时间为30min，分别向离心管中加水，使料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25以及1:30。由于离心管容积为50mL，所以对于料水比为1:30的这项，取两支离心管，每支装1g料粉，加30mL水，使料水比为1:30，并且控制其他提取条件一样将提取液以2000rpm离心15min，收集上清液，再按照同样的超声提取条件重复提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍体积的无水乙醇，静置24h析出多糖，以2000rpm的转速离心15min获得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷冻干燥即得到板蓝根粗多糖。称取一定量的粗多糖，加水定容，测定多糖的含量，并计算提取率。用绘图软件绘制料水比与多糖提取率的关系曲线。2.2.3.3正交试验在做正交试验之前，首先列出本实验的因素水平表。在超声辅助提取板蓝根多糖的工艺中，主要影响因素有三个：提取时间X1、提取温度X2以及料液比X3。参考单因素实验的结果，取最佳单因素条件及其附近的值，作为正交试验中的三个水平，如表3：表3因素水平表水平X1（min）X2（℃）X3(g/mL)135551:20240601:25345651:30本实验中的正交试验为三因素三水平的试验，可以利用L9（34）正交表，映射成的正交表如表4所示，该表仅包含9个水平组合，就能反映包含27个水平组合的情况[10]。表4正交表试验号X1X2X3111121223133421252236231731383219332准确称取料粉2.0g，分别放于5支50mL离心管中，按表4中所列出的提取条件进行超声辅助提取，将提取液以2000rpm离心15min，收集上清液，再按照同样的超声提取条件重复提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍体积的无水乙醇，静置24h析出多糖，以2000rpm的转速离心15min获得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷冻干燥即得到板蓝根粗多糖，计算提取率。计算每一个因素的极差，通过直观分析法找到影响提取率的主要因素，找到最佳因素水平组合。2.2.4体外抑菌实验2.2.4.1大肠杆菌生长曲线的绘制为了使抑菌圈效果更好，应选取处于对数生长期的大肠杆菌接种。由于大肠杆菌的生长曲线根据培养条件的不同，各个周期维持时间也不一样。所以需要预先测量并绘制一条大肠杆菌的生长曲线。取250mL三角瓶两个，在无菌操作条件下，分别加入100mL的LB培养基，一瓶作为实验组，一瓶作为对照。向实验组中接种一环大肠杆菌的保藏菌种，并和对照组一起放到37℃培养箱中培养。在培养时间0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h时，将实验组和对照组取出并摇匀，以对照组作为参比溶液，实验组为被测溶液，于波长600nm处测吸光度值，根据OD值绘出生长曲线。2.2.4.2抑菌圈实验配制LB固体培养基，高压蒸汽灭菌，待培养基冷却到50℃左右时倒平板。培养基冷却后，用移液枪移取100μl大肠杆菌菌液分别加至3个平板中，使用涂布棒将其涂布均匀。先用75%的酒精对牛津杯消毒，再用无菌水冲洗，用镊子取出并将牛津杯直立于培养基上，稍稍压紧，使其与培养基接触无空隙。在平板四周等间距放四个牛津杯，并在相应位置标上1、2、3、4。将1g板蓝根多糖用100mL容量瓶定容配制成浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液，将浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液再稀释3个浓度梯度。用移液枪吸取浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液将1号牛津杯注满；更换枪头，吸取浓度为10-3g/mL的板蓝根多糖溶液将2号牛津杯注满；接着依次吸取浓度为10-4g/mL和浓度为10-5g/mL的板蓝根多糖溶液将3号和4号牛津杯也注满最后盖上陶瓦盖，37℃条件下恒温培养20h，取出用直尺测量并记录抑菌圈的大小。2.2.4.3多糖的抑菌稳定性研究为了探究板蓝根多糖的抑菌机制，以及在不同环境下的抑菌效果，分别选取100℃高温和强紫辐射为测试条件。对于高温环境的测试，将配制好的浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液分别吸取5mL放到4支小试管中，给4只小试管编号1、2、3、4,把1号试管作为对照，2号3号和4号试管分别置于100℃沸水中5min、10min和20min。由于抑菌圈能很好地反映药物的抑菌活性，所以仍然用抑菌圈实验来检测多糖溶液的稳定性。培养基的配置、大肠杆菌的涂布以及牛津杯的摆放与之前实验一样。吸取对应编号的试管中的多糖溶液，把对应位置处的牛津杯注满，盖好陶瓦盖37℃培养20小时。对于紫外线对多糖活性的影响，由于紫外线很难穿透玻璃，所以将配制好的浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液分别吸取10mL放到4个培养皿中，给4个培养皿编号1、2、3、4,把1号培养皿作为对照，2号3号和4号培养皿分别紫外照射10min、20min和30min，取出后在无菌操作条件下，分别将对应位置的牛津杯注满，盖上陶瓦盖，37℃培养20小时。通过对抑菌圈大小的分析，确定板蓝根多糖在不同条件下的抑菌活性，以探讨板蓝根多糖的抑菌机制。2.2.4.4MIC的测定本实验采用倍比稀释法测定板蓝根多糖的MIC值。在无菌操作条件下，取5支试管，用记号笔依次标号1、2、3、4、5。向每支试管中加入5ml灭菌过的LB液体培养基，向1号试管中加入5ml浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液，充分混匀后取出5ml加入到2号试管中，依此做倍比稀释至第5号试管。将活化10小时后的菌液稀释100倍，用移液枪吸取50μl依次加入到每支试管，用脱脂棉塞好，放在37℃下的恒温培养箱中培养16h~24h。取出后观察溶液的澄清度，培养液澄清的最低中药浓度为板蓝根多糖的MIC。3结果与讨论3.1标准曲线葡萄糖的标准曲线如图1所示：图1葡萄糖标准曲线由图1可以看出，以葡萄糖为标准品制作的标准曲线，其回归方程为C（μg/mL）=0.06A490+0.00139，相关系数为R2=0.997，在测得样品中多糖的含量后，按下式计算样品中多糖提取率。多糖提取率（%）=粗多糖中多糖质量/预处理板蓝根粉的质量×100%3.2单因素实验3.2.1超声时间对提取率的影响图2提取时间对板蓝根多糖提取率的影响从图2可以看出，在超声处理10min~40min时多糖的得率随时间的延长有明显的提高，表明超声波能在短时间内破碎细胞，使存在于板蓝根细胞壁和细胞壁之间的多糖物质释放出来。当提取时间在40min左右时多糖得率增长缓慢，提取时间超过40min后提取率反而下降。可能的原因是超声波形成的机械振动有较强的剪切力，使得大分子多糖断裂成小的片段，从而在后处理的过程中损失增大而使得率降低。另外，在测定多糖含量的过程中可以发现当提取时间超过40min时，粗多糖中的多糖含量略微降低，可能的原因是板蓝根细胞经过长时间的超声破碎，细胞内的色素以及其他一些可溶性杂质混入提取液。因此初步确定多糖的超声提取时间在40min左右。3.2.2提取温度对提取率的影响图3提取温度对板蓝根多糖提取率的影响从图3可以看出，当提取温度低于50℃时，提取率很低，高于50℃时提取率有显著提高，但是当提取温度继续升高，超过60℃时提取率却不再增加。说明温度对于提取过程有明显的促进作用。但是考虑到温度过高可能会对多糖活性有破化作用，同时温度过高给后续操作带来不便，成本费用增加。故提取温度应为60℃左右。3.2.3料水比对提取率的影响图4料液比对板蓝根多糖提取率的影响从图4可以看出，随着料水比的增加提取率不断增大，原因可能是超声波将坚硬的细胞壁有效破碎，在溶出有效成分的同时，溶出一些其它液质，而增加溶剂的比例，可以有效降低溶液的黏度，有利于传质扩散。但是当料水比大于1:25时，多糖提取率增加不明显，考虑到在实际操作中溶液体积过大不利于后续的浓缩和醇沉实验操作，并且实验成本增加。由此初步确定多糖的超声提取的料液比为1：25左右。3.3正交实验3.3.1板蓝根多糖提取正交实验在单因素实验的基础上，对影响板蓝根中多糖提取的三个因素（超声时间、提取温度、料水比）进行正交实验，结果见表5。表5板蓝根多糖提取正交实验因素超声时间提取温度料水比多糖得率（%）11119.47212210.36313311.25421311.75522110.16623213.43731212.97832313.2493319.58K131.0834.1929.21K235.3433.7636.76K335.7934.2636.24k110.3611.409.74k211.7811.2512.25k311.9311.4212.08R1.570.872.34在极差分析中R值反映了该因素的水平改变对板蓝根多糖提取率影响的大小。因此从表中可以看出，各因素影响主次顺序为料水比>超声时间>提取温度。最佳提取工艺为超声时间40min、温度65℃、固液比1:25。3.4体外抑菌实验3.4.1大肠杆菌生长曲线的绘制图5大肠杆菌的生长曲线从图5可以看出，大肠杆菌生长的4个时期区分非常明显。0h至4h为迟缓期，休眠状态的大肠杆菌为适应新的环境，生长缓慢；5h至8h为对数生长期，这个时期，培养基中营养物质充足，大肠杆菌成对数快速增长；9h至20h为稳定期，由于培养基中营养物质不断被消耗，有害代谢产物积累以及pH值下降等原因，大肠杆菌繁殖速度下降而死亡的细菌数不断增加，细菌的总数处于稳定的状态；20h到24h为衰亡期，营养物质消耗殆尽，而毒素大量积累，大肠杆菌的繁殖速度逐渐减缓而死亡菌数明显增多，衰亡速度超过繁殖速度，细菌总数呈下降趋势。所以应在培养时间10h左右接种，过早，虽然菌种处于对数生长期，但是菌浓度太低；过迟，虽然菌浓度合适但是菌活性明显降低。3.4.2抑菌圈的测定对大肠杆菌的体外抑菌实验结果如图6所示：图6板蓝根多糖的抑菌圈结果如图6所示，数字①代表的浓度是10-2g/mL，测量得到其抑菌圈直径为1.8cm；数字②代表的浓度是10-3g/mL抑菌圈直径1.6cm；数字③代表的浓度是10-4g/mL抑菌圈直径1.2cm；数字④代表浓度是10-5g/mL抑菌圈直径1.2cm。通过对抑菌圈直径大小的分析，当板蓝根多糖浓度高于10-3g/mL是，多糖溶液有明显的抑菌效果。当板蓝根多糖浓度浓度低于10-4g/mL时抑菌效果不明显。所以当板蓝根溶液浓度大于10-3g/mL时有较明显的抑菌效果。3.4.3多糖的抑菌稳定性研究高温测试结果如图7所示：图7板蓝根多糖的高温测试结果图中，位置①是作为对照组的，未处理的浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液，用直尺量得其抑菌圈直径为1.8cm可以看出抑菌效果很明显。位置②是100℃高温处理5min的板蓝根多糖溶液，抑菌圈直径1.2cm可以看出尽管其抑菌效果受到一定程度的影响，但仍具有抑菌的效果。位置③和④处，分别放置的是高温处理10min和20min的板蓝根多糖溶液，几乎看不到抑菌圈的存在。所以10min左右的高温处理可以让板蓝根多糖完全丧失抑菌活性。所以高温对于板蓝根多糖的抑菌活性有明显的抑制效果。紫外测试结果如图8所示图8板蓝根多糖的紫外照射测试结果图8中，位置①处放的是作为对照组的，未处理的浓度为10-2g/mL的板蓝根多糖溶液，量得抑菌圈直径为1.8cm。从抑菌圈的大小，可以看出未经处理的板蓝根多糖溶液具有很明显抑菌效果。位置②放的是紫外照射10min的板蓝根多糖溶液，抑菌圈直径为1.1cm，抑菌效果受到明显的影响，抑菌效果微弱。位置③和位置④处分别是紫外照射20min和30min的板蓝根多糖溶液，看不出抑菌圈的存在，所以经过20min以上的紫外照射处理，板蓝根多糖会完全失去抑菌活性。从以上的研究可以看出板蓝根多糖很容易受到温度、紫外辐射等外因素的影响而失去抑菌活性。所以想要发挥板蓝根多糖的抑菌效果，需要保持合适的温度，并且避免光照。3.4.4MIC的测定对板蓝根多糖溶液通过试管倍比稀释法进行MIC的测定，结果如图9所示：图9板蓝根多糖MIC的实验结果由图9可以看出，1号以及2号试管中培养基澄清，表示没有大肠杆菌生长；而3号至5号试管中培养基浑浊，表明有大肠杆菌生长，按照最小抑菌浓度MIC的定义，最低没有细菌生长的浓度为MIC。由于本实验采用的是倍比稀释法，所以5支试管中板蓝根多糖溶液浓度分别是0.01g/ml、0.005g/mL、0.0025g/mL、0.00125g/mL和0.00625g/mL。因此可以确定板蓝根多糖的MIC为5mg/mL。

结论本实验首先通过单因素试验及正交试验研究了板蓝根多糖的最佳提取工艺条件，得出板蓝根多糖的最佳提取工艺为超声时间40mi