临床生化干扰实验批准指南专家讲座

临床生化干扰试验同意指南(EP7-A)广东省中医院检验科徐建华临床生化干扰实验批准指南第1页目

为临床生化检验结果中研究、判别和确定干扰物质效应提供背景信息、指导和试验程序

专门为厂商和临床试验室制订

临床生化干扰实验批准指南第2页作用

对厂商来说，经过EP7程序能够筛选潜在干扰物质，量化干扰效应，证实病人样本中干扰，确认分析方法对干扰物质敏感性，评定潜在风险，并将有意义干扰申明提供给用户。对于临床试验室来说，经过EP7调查策略，要求数据搜集和分析要求，确认干扰申明，研究明确干扰物质带来结果差异，确保分析方法符合临床要求。临床生化干扰实验批准指南第3页主要内容干扰相关概念与理论适用范围干扰试验判断标准干扰分析前质量确保干扰测定用病人标本评价干扰建立、确认和验证干扰申明调查分析与临床不一致病人结果临床生化干扰实验批准指南第4页术语分析物(Analyte)：试验室测试物质或者成份干扰物（Interferent)：样本中不一样于分析物并能引发测量偏倚成份干扰：在临床生化中，因为另一成份影响或样本特征，待测一定浓度被分析物出现有临床意义偏倚干扰标准：干扰物所允许最大结果偏倚干扰敏感度：某一分析方法对来自其它成份或者样本特征干扰引发误差敏感性

临床生化干扰实验批准指南第5页术语干扰申明：一个物质影响分析方法结果效应陈说干扰筛选：分析系统评价中，利用高浓度样品进行一系列能判别有可能发生干扰物质差异结果//异常结果//假性结果（Discrepantresult//Anomalousresults//Spuriousresults)：一个与临床不一致结果，或同一标本另一个不一样结果，或与其它方法不一样结果，或与已确定临床诊疗不相符结果临床生化干扰实验批准指南第6页

术语内源性干扰：样本中一些生理物质（比如胆红素、血红蛋白），可对另一些物质分析时引发干扰。外源性干扰：一个源自体外物质（比如，药品或其代谢物，防腐剂，污染物），可对样本中另一物质分析引发干扰。临床生化干扰实验批准指南第7页术语验证（validation）：经过调查及提供客观证据，证实能够满足某期望用途特定要求。(users’requirementshavebeenmet(e.g.,accuracyrequirementsforpatients’results)确认(verification)：经过调查及提供客观证据,确认满足了特定要求。(specifiedcriteriahavebeenmet(e.g.,interferencecriteriaorinterferenceclaims)临床生化干扰实验批准指南第8页适用范围1.适用大部分析方法和仪器，特殊方法可能需要必要调整，如分离技术和免疫学分析方法在附录A中被讨论。2.血清、血浆、全血、脑脊液、尿和其它大多数体液等标本类型都可用本指南评定临床生化干扰实验批准指南第9页3.适用以下干扰物质：

病理情况下代谢物，如胆红素、脂肪、蛋白质、血红蛋白等；病人治疗期间引入物质，如药品、肠外营养、血浆代用具、抗凝剂等；病人吸收物质，如药品滥用、营养补充等；标本准备引入物质，如抗凝剂、防腐剂等；标本处理过程中引入污染物，如手霜、滑石粉、促凝剂等；标本本身基质效应，其理化性质跟理想新鲜标本不一样。适用范围临床生化干扰实验批准指南第10页1.干扰对不准确度影响

不准确度（总分析误差）包含不精密度、方法特异性偏倚和样本特异性偏倚（干扰），对干扰物质敏感性能够引发系统误差和随机误差。基本概念临床生化干扰实验批准指南第11页2.分析前效应

分析前分析物或者它浓度改变通常称为“分析前效应”，这些作用可能会影响试验结果临床应用，但不能视作“分析干扰”。这些作用：体内药品作用，如使用药品后因生理响应使激素浓度改变标本处理，因为蒸发、溶血或者血清长时间不分离使电解质、蛋白、水含量改变标本搜集，如在静脉滴注时（内含分析物）取样

基本概念临床生化干扰实验批准指南第12页3.绝对干扰与相对干扰

干扰作用可看成是绝正确或相正确绝对干扰：普通病人标本中含有某物质，一旦它存在即会引发干扰。相对干扰：普通病人标本中含有某物质，其含量相对于混合样品中平均浓度，不一样病人样品中含有该物质浓度改变引发干扰作用改变，相对干扰作用在临床试验中更有意义。基本概念临床生化干扰实验批准指南第13页基本概念

相对干扰一些方法能够校正干扰物平均浓度做赔偿，以使病人标本中干扰效应减小到最低，有代表性方法包含样品前处理、设置空白对照、标准血清校准和数学校正，当干扰物浓度大于或者小于病人样本中平均浓度时将引发误差。临床生化干扰实验批准指南第14页基本概念4.干扰机制因为某干扰物存在以各种方式影响分析过程，主要机制：物理作用干扰物含有物理性质，使它与分析物一样被检测出来，如颜色、光散射（光吸收）、洗脱位置、电极响应等。干扰物可能会改变标本物理特征，如表面张力、黏度、浊度、离子强度等，干扰检测结果。临床生化干扰实验批准指南第15页基本概念干扰机制化学作用

干扰物可能会影响酶活力，比如，阻止金属激活剂结合到活性中心上去，氧化必须巯基等。干扰物也可破坏或阻止反应，比如，破坏试剂或抑止指示反应。干扰物也可改变分析物形式，比如，形成复合物或沉淀。临床生化干扰实验批准指南第16页基本概念4.干扰机制非特异性干扰物可能和分析物以一样方式参加反应，比如，苦味酸肌酐方法中酮酸干扰，重氮胆红素方法重吲哚酚硫酸盐干扰。在免疫化学方法中干扰物和抗体发生交叉反应。比如，茶碱方法中咖啡因干扰。临床生化干扰实验批准指南第17页基本概念4.干扰机制水取代作用非水物质（蛋白质、脂质），因为取代了血浆中部分水体积，影响了一些分析物测定。这些作用考虑或不考虑为干扰作用，取决于要求结果是以总体积浓度表示，还是以血浆水浓度来表示。临床生化干扰实验批准指南第18页干扰试验判断标准

为确保客观性，可接收标准必须在评价试验操作之前就确定。建立可接收标按时，必须考虑临床意义和统计学意义二者之间差异。临床生化干扰实验批准指南第19页1.临床可接收标准基于生理变异源于临床经验基于被分析物变异干扰试验判断标准

临床生化干扰实验批准指南第20页2.统计学意义在确定一个物质是否存在干扰前，首先确定所得到结果是否有统计学意义。3.分析物检测浓度干扰应该在两种医学决定浓度被评定，假如在一个浓度上进行测试，要注意有可能漏过在其它分析物浓度水平上有临床意义干扰。干扰试验判断标准

临床生化干扰实验批准指南第21页干扰试验判断标准4.干扰物检测浓度决定一个物质在“最坏情况”条件下是否会产生干扰，干扰筛选应该在试验室期望观察到最高浓度水平病人样本中进行。5.潜在干扰物质临床生化干扰实验批准指南第22页干扰分析前质量确保在进行一个干扰试验之前，必须进行：培训和熟悉精密度确认--EP5《临床生化设备性能精密度评价》准确度确认--EP9《利用病人样本进行方法学比较和偏倚评定》携带污染评价质量控制--C24《内部质量控制试验：原理和定义》标准化防范—M29《试验室工作人员防止职业感染》安全性和废物处置--参考厂商标签和材料安全数据表（MSDS）临床生化干扰实验批准指南第23页干扰测定（Determinationofinterferencecharacteristics)第一个方法：评价潜在干扰物添加到样本后干扰效应（干扰筛选）第二种方法：评价个别有代表性病人结果与高特异性比较方法结果偏倚（用病人标本评价干扰）临床生化干扰实验批准指南第24页干扰筛选

将阳性干扰物加入测定样品中，与不加对照组比较有没有偏移，称为“配对差异”试验。普通最有效方法是在较高浓度下对系列可能干扰物作初步筛选，假如临床显著意义，则该物质不是干扰物，无须深入试验。反之，含有临床显著意义，应深入评价以确定干扰物浓度与干扰程度间关系，这类试验称为“剂量效应”（dose－response）试验临床生化干扰实验批准指南第25页试验设计1.测试组和对照组在同一个分析批内完成；2.计算重复测量次数：有临床意义最小差异值；假设检验水准；重复性（批内精密度）。临床生化干扰实验批准指南第26页试验材料

1基础标本（Basepool）

从几个健康、没有进行药品治疗个体取得适当类型（血清、尿等）新鲜样本，基础样本应能反应样本基质，能反应分析物特点。适当冰冻或冻干样本，确认测试材料是否与临床样本相同计算所需样本量

测定基础标本中分析物浓度并用适当纯物质调整测试管分析物浓度到医学决定浓度，应防止加入分析物时引入其它物质，推荐分析物测试浓度见附录B。临床生化干扰实验批准指南第27页试验材料2.贮存液取得适当而纯潜在干扰物，或者该物质最靠近体内循环状态形式选择一个能够充分溶解分析物溶剂

尽可能小地稀释样本基质，最好小于5%。假如溶解度允许，通常配制成浓缩20倍贮存溶液有机溶剂需要特殊对待，氯仿最少要求1：100稀释倍数，乙醇浓度大于1～2％时能够使抗体变性。临床生化干扰实验批准指南第28页3.对照样本用制备贮存液相同体积溶剂替换测试干扰物，其它要求与测试样本相同。假如对照样本中存在测试物质（比如胆红素），使用适当分析方法确定它浓度。假如对照样本中被分析物浓度与基础样本中显著不相符，考虑溶剂为潜在干扰物。试验材料临床生化干扰实验批准指南第29页重测次数要求重测次数取决于统计学假设水准当有效假设检验不能确定干扰方向（正或负）时使用双侧检验，当有效假设检验包含干扰方向（正或负）时使用单侧检验临床生化干扰实验批准指南第30页重测次数要求双侧检验：Z1-

/2：100(1－ß)%置信水平，z1－ß：100（1－ß）％检验效能，s是重复性标准差。dmax是分析物在测试浓度范围内最大允许干扰。单侧检验：

用Z1-

代替Z1-

/2临床生化干扰实验批准指南第31页

z百分位值：重测次数要求临床生化干扰实验批准指南第32页

z百分位值：举例：检测可接收干扰程度为1.5mg/dL干扰效应，95％（

＝0.05）检验水按时，重复性（批内精密度）为1.0mg/dL,计算重复次数：重测次数要求临床生化干扰实验批准指南第33页批内标准差（dmax/s）倍数：

95％（

＝0.05）检验水按时检测不一样干扰效应所需重测次数以下：

重测次数要求临床生化干扰实验批准指南第34页批内标准差（dmax/s）倍数：举例在1mg/dL肌酐浓度水平，批内重复测定标准差为0.075mg/dL，试验室认为0.1mg/dL是一个有意义干扰。需要测定多少次，可能干扰能被检测到？首先，把不准确度表述为批内重复测定标准差倍数：0.1mg/dL/0.075mg/dL=1.33。将1.33向前舍入一位为1.3，上表决定重复测定次数，得出在95％（

＝0.05）检验水按时，每个对照和测试样品需要重复测定16次。重测次数要求临床生化干扰实验批准指南第35页试验程序

“配对差异”试验：

1)适当分析物浓度；2)建立有临床意义差异标准（dmax）；3)确定每个样品所需重复测量次数；4)准备临床基础标本；5)准备20倍浓缩贮存液（潜在干扰物），假如使用另外一个浓度）确定，按照步骤6和8稀释（推荐浓度见附表C）;临床生化干扰实验批准指南第36页6)用吸管吸收1/20容器体积浓缩贮存液到容量瓶中，称为测试样品，7)用基础液补足到刻度体积，充分混匀；8)用吸管吸收1/20容器体积制备贮存液溶剂到第二个容量瓶，称为对照样品。9)基础液补足体积，充分混匀；10)准备能够被n整除测试样本和对照样本，重复测定次数n由第三步确定；试验程序

临床生化干扰实验批准指南第37页11)按交互次序分析测试（T）和对照（C）样本；假如检测系统受携带污染影响，增加额外样本使对照样本免受来自测试样本携带污染影响。增加额外对照样品Cx结果应舍弃。12)统计结果，进行数据分析。试验程序

临床生化干扰实验批准指南第38页数据分析.1

计算观察到干扰效应“点预计”，即dobs，是测试样本均值和对照样本均值之间差值。2计算cut-off值ｄc（双侧检验）ｄnull是无效假设要求值，通常＝0，对于单侧检验，用Z1－

取代Z1－

/2。临床生化干扰实验批准指南第39页3.计算95％置信区间干扰效应95％置信区间＝数据分析s是测量方法重复性批内精密度，n是每个样本重复测量次数，t0.975n-1为t检验数值表中97.5%和n-1自由度时值（n>30，2.0是t0.975n-1合理近似值）。临床生化干扰实验批准指南第40页结果解释假如点预计dobs值小于或等于cut-off值dc，能够得出某种物质引发偏倚小于dmax；不然，接收有效假设，说明由该物质引发干扰假设成立。临床生化干扰实验批准指南第41页当解释干扰测试结果时考虑以下情况：因为吸样错误，真实干扰可能不一样于观察到“点预计”。假如无效假设成立，置信限100（1－

）％接收它；假如有效假设检验成立，置信限100（1－ß）％接收它。相反置信限分别为100

％和100ß％。假如被检物为非人血清成份检测，可能会引入人造物品误差测试浓度随意选择可能不显示干扰结果解释临床生化干扰实验批准指南第42页当一个或各种分析物浓度出现干扰效应，则可经过剂量效应曲线确定不一样干扰物浓度干扰程度，干扰物不一样浓度可经过最高值干扰物浓度样本和对照样本混合制备。普通情况下，做剂量效应曲线时每个测试浓度水平重复测量三次足够。如计算每个浓度所需重复测量次数，也可用附录中公式计算。“剂量效应”试验临床生化干扰实验批准指南第43页测试材料1.基础标本2.贮存液3.高浓度样本---用基础标本稀释贮存液，制备成所需浓度。4.低浓度样本准备一组低含平均浓度干扰物临床样本，在大多数情况下，治疗药品，或血红蛋白、胆红素能够忽略不计，低浓度样本制备可参考对照样本制备方法临床生化干扰实验批准指南第44页测试材料5.测试样本---制备一系列不一样浓度干扰测试样本，通常五个浓度足够确定一个线性剂量效应关系。临床生化干扰实验批准指南第45页剂量效应试验程序

1)测定待测最高和最低标本浓度水平；2)确定被认为“有临床意义”差异，假如曾做过“配对差异”试验，这一步已经完成；3)确定在每个浓度重测次数n（见附录E），通常3次；4)准备高中低系列浓度样本；临床生化干扰实验批准指南第46页剂量效应试验程序

5）按照第三步n值大小准备每份标本量；6）在同一分析批之内检测5个样本浓度，第一组按照升序测定各样本，第二组按降序测定，第3组按照升序等等，平均系统漂移影响；或按随机次序检测全部样本，到达最小化漂移效应；7）计算低浓度样本平均值，其它各组结果中减去该低浓度样本平均值，然后把最终净结果填入表格中进行数据分析。临床生化干扰实验批准指南第47页数据分析将结果点在图上，y轴为干扰结果，x轴上为干扰物浓度，观察剂量效应关系曲线形状：

线性效应非线性效应临床生化干扰实验批准指南第48页线性效应

数据随机分布，大约成一条直线，用最小二乘法进行回归分析，在图上划出回归直线，确定适合全部数据点，其效应曲线是线性。临床生化干扰实验批准指南第49页与干扰物浓度相关线性干扰举例：线性效应

五个浓度水平剂量效应线性关系结果临床生化干扰实验批准指南第50页线性效应

剂量效应回归分析临床生化干扰实验批准指南第51页线性效应

线形回归95%可信区间范围从干扰物浓度与置信区间改变大小函数能够看出，在95%置信区间内结果最可信是中间干扰物浓度范围

临床生化干扰实验批准指南第52页非线性效应干扰物浓度干扰可能不是一个线性函数，假如绘图数据显示是弯曲，那么对一个给定干扰物浓度干扰程度适当预计能够用图解形式表示。临床生化干扰实验批准指南第53页举例：非线性效应五个系列浓度剂量响应非线性结果

临床生化干扰实验批准指南第54页非线性效应非线性剂量效应回归分析

任何浓度水平干扰物干扰程度能够从图表中被预计，也能够用非线性回归方程计算。临床生化干扰实验批准指南第55页

回归线斜率代表每单位干扰物偏倚，y轴上截距表示内源性干扰浓度校正，经过回归方程或者图表，任何干扰物浓度水平干扰程度都可被预计。假如斜率是正，试验显示该物质引发一个正干扰。结果解释临床生化干扰实验批准指南第56页分析物和干扰物联合评价在单一试验中，干扰物浓度和分析物浓度在检测过程中有组织设置，两个或更多潜在干扰物能被更有效同时检测，单一成份干扰效应可经过单原因分析方法评定，多原因试验设计描述，参见Box和Hunter文件。优点：提升效率和提供更多信息，干扰物质之间及干扰物与分析物之间相互作用都能被评价。不足之处是样本准备愈加复杂，增加了人为误差发生可能性。临床生化干扰实验批准指南第57页干扰筛选不足在临床标本中真实干扰物可能不是原来药品，而是代谢产物。试验标本基体并不代表经典有问题临床标本。加入物质与临床标本中干扰物不相同，比如，蛋白结合、沉淀，或不均一性（异质性）。试验水平可能选择得太高或太低以至不真实。临床生化干扰实验批准指南第58页干扰测定第二种方法：

用病人样本评价干扰

第一个方法不论考虑多么全方面，在病人血清标本中可能碰到意想不到干扰。为了最大程度降低这种情况发生，应该分析来自病人真实标本以评价内在不一样血清标本间变异性。假如某个标本中出现一个可重复“离群值”，则说明该标本中有未知干扰物质存在。临床生化干扰实验批准指南第59页试验设计

被评价方法和参考方法（或者其它被认定合格比较方法）同时测定两组病人样本（测试组和对照组），假如测试组与对照组结果出现有意义偏倚，存在干扰。参考方法或比较方法对干扰物有低敏感性。临床生化干扰实验批准指南第60页测试标本选择标准：疾病（比如，来自心脏病、肝病或肾病病人标本）；药品（比如，使用过某种想了解药品病人标本）；其它不正常组分（比如，含有不正常胆红素、脂质、血红蛋白或蛋白标本）。

临床生化干扰实验批准指南第61页对照标本

选择标准：没有使用目标药品；潜在干扰物质在正常浓度范围内；相同或者相同诊疗；分析物分布状态与测试标本相同；对照样本必须包含在每一分析批内。临床生化干扰实验批准指南第62页试验程序1.计算测试标本和对照标本数，取决于：两种方法精密度；干扰效应大小；要求假设检验水准。2.挑选测试组和对照组标本；3.选择适当参考方法或者效果很好比较方法；临床生化干扰实验批准指南第63页4.在尽可能短时间内（通常在两个小时内），用两种方法重复测定每个样本。5.假如观察到偏倚存在，测定样本中药品或者其它潜在干扰物质浓度，假如可能话，确定偏倚和干扰物浓度二者之间关系。试验程序临床生化干扰实验批准指南第64页数据分析

计算测试组和对照组平均值之间差值，并与干扰标准进行比较，然后确定干扰能否被排除或者需要深入研究。临床生化干扰实验批准指南第65页1.与比较方法结果作偏倚图计算重复测定结果均值；计算每个样本平均偏倚（测试方法结果减去比较方法结果）；作图：偏倚在垂直轴上，比较方法浓度在水平轴，测试和对照样本用不一样记号标识；经过线性回归分析计算每一组Sy,x统计量（比较方法＝x），它可用于计算95％置信区间。数据分析

临床生化干扰实验批准指南第66页2.可能干扰偏倚评定：数据分析（A）相对于对照组正偏倚(B)相对于对照组没有偏倚－成百分比方法偏倚(C)相对于对照组负偏倚(D)相对于对照组没有偏倚

临床生化干扰实验批准指南第67页3.以潜在干扰物绘制偏倚曲线假如病人标本中可疑干扰物浓度已知，能够判断它是否与取得偏倚相关。数据分析

一个与潜在干扰物浓度相关很好干扰效应临床生化干扰实验批准指南第68页用病人样本评价干扰---不足（1）对试验变异缺乏控制对照（2）本方法并不能确定原因与作用关系，它只能说明偏倚与预计干扰物某水平相对关系（3）假如标本不新鲜，将会失去一些易变组分（比如，乙酰乙酸、CO2等）临床生化干扰实验批准指南第69页用病人样本评价干扰—不足4）病人通惯用各种药品，所以，难于证实何种药品干扰作用5)按疾病和用药对病人分类，不是不可能，至少对许多试验而言是非常困难6)试验是一个机遇，成功取决于在检测病人人群标本中是否有此干扰存在临床生化干扰实验批准指南第70页7)极少有公认参考方法。有参考方法难以在常规试验室中使用。另外，参考方法可能也一样被干扰。

不论怎样，第二种方法对证实干扰物是有用，这也是唯一方法可检出药品代谢物干扰作用，它也可必定在真实标本中有干扰方法。用病人样本评价干扰---不足临床生化干扰实验批准指南第71页建立、确认和验证干扰申明EP7-A可被厂商用于验证和确认特异性，建立干扰申明，临床试验室也可用它检验厂商申明以及确认方法特异性是否满足医学要求。临床生化干扰实验批准指南第72页干扰申明

对于商业方法来说，已知干扰物质应在使用明书中阐述，试验证实没有干扰物质