临床生化与生化技术检验专家讲座

生化技术

BiochemicalTechnique

上海第二医科大学检验系

临床生化与生化技术检验

1医学资料临床生化与生化技术检验第1页一.什么是生化技术？

生化技术是研究生物体化学组成

、结构、功效以及在生命活动中化学物

质代谢、调整控制等试验方法。

2医学资料临床生化与生化技术检验第2页内容：生物大分子普通制备分子生物学基本操作3医学资料临床生化与生化技术检验第3页

分离纯化检测生物大分子

电泳Electrophoresis

层析Chromatography

离心Centrifugation

检测光谱分析法

分离4医学资料临床生化与生化技术检验第4页二.生物大分子普通制备法

体液：直接分离生物样品

组织细胞：先破细胞

分离

检测

5医学资料临床生化与生化技术检验第5页生物大分子制备四个阶段选择材料和预处理组织细胞破碎及细胞器分离生物大分子分离纯化浓缩、干燥和保留6医学资料临床生化与生化技术检验第6页（一）材料选择和预处理：

微生物植物动物7医学资料临床生化与生化技术检验第7页（二）组织细胞破碎方法：

1.物理方法：

玻璃匀浆器(homogenizer)

8医学资料临床生化与生化技术检验第8页研钵（加净砂或玻璃粉）

9医学资料临床生化与生化技术检验第9页高速组织捣碎器

10医学资料临床生化与生化技术检验第10页超声波

11医学资料临床生化与生化技术检验第11页

渗透压法

重复冻融法

12医学资料临床生化与生化技术检验第12页2.化学方法

有机溶剂（破坏细胞膜脂质

双分子层）

3.酶法

自溶法（蛋白酶、酯酶）

酶解法（溶菌酶破坏细胞壁

-1，4-糖苷键）

13医学资料临床生化与生化技术检验第13页（三）生物大分子分离、纯化

以蛋白质为例

【提取】相同相溶

1.水溶液提取

中性盐溶液提取：

缓冲液提取：

2.有机溶剂提取

14医学资料临床生化与生化技术检验第14页【分离纯化】

1.依据蛋白质溶解度不一样分离方法：

（1）盐溶与盐析

（Saltingin&Saltingout)

蛋白质、酶及其它们与其它物质复合体在离子强度低盐溶液中，其溶解度伴随盐溶液浓度升高而增加，此现象称为“盐溶”。15医学资料临床生化与生化技术检验第15页

当溶液中盐浓度不停上升，到达一定程度，蛋白质等溶解度反而逐步减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。

16医学资料临床生化与生化技术检验第16页盐析作用产生

因为盐离子同水分子发生水合作用，

造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子，

减弱了蛋白质水合程度。

蛋白质表面电荷被盐溶液中对应

离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋

白质等溶解度下降，蛋白分子相互

聚集而沉淀析出。17医学资料临床生化与生化技术检验第17页

中性盐选择

硫酸铵(NH4)2SO4

硫酸钠Na2SO4

18医学资料临床生化与生化技术检验第18页例：分离球蛋白和白蛋白

血清1ml

1mlPBS充分混合。

逐步加入饱和(NH4)2SO4

溶液至50%，边加边搅拌。

离心

上清沉淀（球蛋白）

19医学资料临床生化与生化技术检验第19页（2）等电点沉淀法（溶解度最小）

PIMWAlb4.8666000α15.02130000α25.02200000β5.121300000γ6.8~7.3150000020医学资料临床生化与生化技术检验第20页（3）低温有机溶剂沉淀法

△甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低

并析出。

△脱水、介电常数小

△分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在

低温下进行。

（4）聚乙二醇沉淀法

21医学资料临床生化与生化技术检验第21页2.依据蛋白质分子大小不一样

分离方法：22医学资料临床生化与生化技术检验第22页

（1）透析和超滤

（Dialysis&Ultrafiltration)

透析：

利用溶液组分能否经过半透膜并由引发膜两边溶液化学势能不一样，而到达去除溶液中小分子物质。

超滤（反向渗透）

利用压力或离心力，迫使水和其它小溶质分子经过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。23医学资料临床生化与生化技术检验第23页（2）凝胶层析法（GelChromatography)

利用各种物质分子大小不一样，在固定相上受到阻滞程度不一样而到达分离一个层析方法。

（3）SDS24医学资料临床生化与生化技术检验第24页3.依据蛋白质带电性质差异分离方法：

醋酸纤维素薄膜电泳

琼脂糖凝胶电泳

电泳法

聚丙烯酰胺凝胶电泳

等电聚焦电泳

离子交换层析法25医学资料临床生化与生化技术检验第25页醋酸纤维素薄膜电泳

血清蛋白质分离

分子量pI

白蛋白660004.86

α1球蛋白1300005.02

α2球蛋白005.02

β球蛋白13000005.12

γ球蛋白15000006.8-7.326医学资料临床生化与生化技术检验第26页—+白蛋白α1α2βγ加样27医学资料临床生化与生化技术检验第27页

+—28医学资料临床生化与生化技术检验第28页清蛋白Albα2α1βγ+—29医学资料临床生化与生化技术检验第29页30医学资料临床生化与生化技术检验第30页琼脂糖凝胶电泳从海藻中提取出来一个线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。31医学资料临床生化与生化技术检验第31页分离血浆脂蛋白

脂质蛋白质直径

CM98%2%100

VLDL90%10%75

LDL70%30%20

HDL50%50%1032医学资料临床生化与生化技术检验第32页

加样槽β前βα

CMLDLVLDLHDL—+33医学资料临床生化与生化技术检验第33页—+34医学资料临床生化与生化技术检验第34页聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）丙烯酰胺结构式35医学资料临床生化与生化技术检验第35页（2）亚甲双丙烯酰胺36医学资料临床生化与生化技术检验第36页37医学资料临床生化与生化技术检验第37页等电聚焦电泳载体两性电解质38医学资料临床生化与生化技术检验第38页39医学资料临床生化与生化技术检验第39页离子交换层析法40医学资料临床生化与生化技术检验第40页41医学资料临床生化与生化技术检验第41页4.依据配体特异性分离法：

亲和层析

42医学资料临床生化与生化技术检验第42页5.依据被分离分子密度

--离心技术43医学资料临床生化与生化技术检验第43页【判定】

检测--光谱分析法

RNA&DNA260nm

蛋白质280nm

44医学资料临床生化与生化技术检验第44页（四）浓缩、干燥、保留[样品浓缩]1、减压加温蒸发浓缩2、空气流动蒸发浓缩3、冰冻法4、吸收法5、超滤45医学资料临床生化与生化技术检验第45页[干燥]真空干燥——适合用于不耐高温，易于氧化物质干燥和保留。冷冻干燥——在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。

46医学资料临床生化与生化技术检验第46页[保留]1、干燥制品贮存2、液态贮存样品不能太稀普通需加入防腐剂、稳定剂低温贮存47医学资料临床生化与生化技术检验第47页三、分子生物学技术重组DNA技术基本步骤

1.目标基因取得

2.目标基因与载体连接

3.重组DNA分子导入受体细胞

4.筛选出含重组DNA基因分子受体细胞克隆

5.克隆基因表示及表示产物检测和分离DNA提取：组织、细胞、质粒

RNA提取：组织、细胞

PCR技术：常规PCR、RT-PCR

限制性内切酶

Westernblot48医学资料临床生化与生化技术检验第48页四.生化技术特点：

1.条件温和

2.试验条件与机体内环境尽

量符合

49医学资料临床生化与生化技术检验第49页五.生化技术应用：

1.工业、农业研究、生产

2.生化研究

3.临床应用、诊疗

50医学资料临床生化与生化技术检验第50页六.发展趋势：

超微量

高效

自动化

快速

综合联用

比色--计算机51医学资