医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生专家讲座

医学细胞生物学

第十七章

干细胞与组织维持和再生高级讲师王波bonnie_wang70@163.com

中山大学中山医学院生物教研室医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第1页第17章

干细胞与组织维持和再生干细胞概述胚胎干细胞组织干细胞干细胞与医学医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第2页干细胞stemcell最早在1896年提出；上世纪60年代，发觉小鼠骨髓中有造血干细胞，能够分化为不一样类型血液细胞；80年代，小鼠胚胎干细胞被成功分离和培养，证实含有三胚层分化潜能；90年代后，人类胚胎干细胞、组织干细胞陆续分离培养成功干细胞存在受精卵分裂3次之前（即8细胞前）每个细胞都含有发育为完整个体可能性，这种含有发育全能性早期胚胎细胞，称之全能干细胞totipotentstemcell随胚胎发育进行，早期胚胎形成一个中空球形——胚泡，胚泡内侧一个小细胞团——内细胞团innercellmass,ICM内细胞团细胞含有分化为成熟个体中全部类型细胞潜能，干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第3页是多能干细胞pluripotentstemcell内细胞团细胞体外培养，就是习惯上说胚胎干细胞内细胞团在体内快速增殖和分化，形成三胚层及对应脏器参加胚胎各种组织器官发育干细胞，通常只分化与其对应组织器官组成细胞，在组织器官发育过程中起主要作用，称组织特异性干细胞tissuespecificstemcell，是一个专能性干细胞multipotentstemcell干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第4页成体干细胞somaticstemcell或adultstemcell：存在于出生后个体组织中干细胞，基本生物学功效是经过有序增殖与分化，实现所在组织中细胞新旧更替，维持组织器官结构和功效动态平衡造血系统、皮肤、小肠等细胞更新旺盛组织器官中，对应组织干细胞十分活跃；肝脏等器官中组织干细胞在正常生理状态下，处于静息状态，当组织器官受到损伤后，才被激活快速增殖与分化哺乳动物全部组织中都有组织干细胞干细胞形态和生化特征全部干细胞在形态学上都含有原始细胞一些基本特征：细胞体积较小、核/质百分比相对较大，细胞质中细胞器不够发达干细胞生化特征：与所在组织类型亲密相关，通常分化程度没有组织细胞高、通常端粒酶活性很高、胚胎干细胞常表示阶段特异性癌胚抗原等蛋白分子干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第5页大多数组织干细胞存在部位当前仍未确定，不一样组织干细胞表示分子标识，有利于对其区分和研究干细胞增殖特征1.干细胞增殖速率含有迟缓性干细胞进入分化程序后，先经过一个短暂增殖期，产生过渡放大细胞，其意义在于降低干细胞分裂次数，产生较多分化细胞干细胞本身增殖速率很慢，而组织中过渡放大细胞分裂速度较快干细胞迟缓增殖生理意义：①有利于干细胞对特定外界信号作出反应，决定进入生殖状态还是进入特定分化程序；②降低基因突变危险，使干细胞有更多时间发觉和校正复制错误，而对无法修复细胞，进入凋亡程序干细胞不但补充组织细胞，还含有预防体细胞自发突变作用干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第6页2.干细胞增殖系统含有自稳定性自稳定性self-maintenance：干细胞能够在生物个体生命期间内自我更新并维持其本身数目恒定特征，这是干细胞基本特征之一干细胞发生分裂后，产生两个子细胞都是干细胞或都是分化细胞，这种分裂方式称：对称分裂symmetricdivision假如干细胞分裂后，产生两个子细胞，一个干细胞，一个分化细胞，称为：不对称分裂asymmetricdivision无脊椎动物，不对称分裂是干细胞维持本身数目恒定基本方式哺乳动物，单个干细胞通常进行对称分裂；在干细胞群体中，是不对称分裂干细胞不对称分裂机制存在，使得机体对干细胞调控更灵活，以应对机体生理变化需要干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第7页机体保持干细胞数目恒定，直接关系到机体各组织细胞数目恒定，对保持组织稳定和正常功效非常主要；高等哺乳动物，对干细胞调控是多角度多层次干细胞分化特征1.干细胞分化含有谱系限定性个体各种组织都有干细胞存在，它们含有产生特定功效细胞分化潜能；这些干细胞分化潜能，在不一样发育阶段和不一样组织器官中，含有严格谱系限定性在囊胚着床后发育中，组织干细胞通常只能分化产生所在组织内功效细胞，即只产生其谱系内细胞类型干细胞分化谱系限定性有复杂和严格调控机制，是当今干细胞研究领域热点之一2.干细胞分化含有一定可塑性干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第8页在一些特殊条件下，干细胞分化能够失去原来谱系限制性，而产生原来谱系以外细胞类型，称：干细胞可塑性1997年，在小鼠试验中发觉造血干细胞可分化成脑组织中胶质细胞iPS细胞，是经过转染特定转录因子基因，使成纤维细胞分化为类似ES细胞多能干细胞——去分化dedifferentiation(使干细胞向其前体细胞逆向转化现象)将一个已分化细胞直接诱导为另一个已分化细胞——转分化transdifferentiation将多潜能干细胞直接诱导为一个特定分化细胞——直接诱导分化directlyinduceddifferentiation干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第9页干细胞生理活动微环境干细胞生理活动主要包含：增殖和分化干细胞增殖与分化被严密调控，其调控机制与其所在组织微环境microenvironment相关，也称：干细胞巢或干细胞龛stemcellniche干细胞巢基本特征：由干细胞及外围细胞、参加增殖分化调控相关因子组成，并含有动态平衡特征局部环境干细胞巢结构体系中参加干细胞增殖分化调控相关原因3点：1.干细胞巢中分泌因子是干细胞增殖分化调控因子干细胞巢分泌因子，能够是干细胞本身分泌，也能够来自周围细胞或其它组织细胞不一样干细胞微环境，或不一样生理、发育状态下，分泌因子种类及表示多少差异很大干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第10页TGF-β和Wnt家族信号分子，参加调控各种干细胞不对称分裂以及维持干细胞自我更新2.细胞间直接相互作用也是干细胞增殖分化一个调控原因在干细胞巢中，除分泌因子外，许多调控经过细胞间直接接触起作用，是由整合膜蛋白介导：一个细胞膜整合蛋白胞外段作为配体，另一个细胞膜整合蛋白胞外段作为受体Notch介导细胞间作用对果蝇感受器官正常发育必不可少3.整联蛋白和胞外基质参加干细胞巢结构体系形成全部动植物细胞均表示整联蛋白，β-integrin对干细胞增殖分化起主要作用；整联蛋白维系干细胞在组织中空间位置胞外基质调整干细胞微环境中分泌因子浓度，整联蛋白激活也受胞外基质调整当前研究挑战之一是确定干细胞巢中各种关键作用因子类型干细胞概述医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第11页囊胚中→内细胞团→分离出在体外培养→胚胎干细胞→体外无限扩增+遗传操作+体外条件诱导分化→嵌合体胚胎胚胎干细胞在哺乳动物早期胚胎发育、细胞分化、基因表示调控等方面含有特殊意义和实用价值胚胎干细胞生物学特征对胚胎干细胞认识主要基于体外培养来间接分析1.胚胎干细胞含有原始细胞形态和生化特征体积较小、核质比大、内质网高尔基体等不发达；在囊胚中集落样附着于囊胚内侧壁，即内细胞团；在体外培养条件下依旧是致密集落样生长，形似鸟巢各种哺乳动物胚胎干细胞体外培养形态特征都类似胚胎干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第12页3.胚胎干细胞含有向三个胚层组织细胞分化潜能胚胎干细胞体外培养证实了其可分化为个体任何组织细胞潜能：①人胚胎干细胞+胎鼠成纤维细胞(喂养层)=内胚层+滋养层；胚胎生殖细胞+白血病抑制因子=类胚体(三胚层各种类型细胞)②人胚胎干细胞+免疫缺点小鼠皮下=胚胎组织瘤(三胚层各种细胞)③体外培养小鼠胚胎干细胞+显微注射到小鼠囊胚腔=嵌合鼠(胚胎干细胞分化为包含生殖细胞在内各种组织细胞)胚胎干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第13页胚胎干细胞体外分化胚胎干细胞在医学上应用思绪：胚胎干细胞→诱导形成胚状体(类胚体)→分离所需细胞→扩大培养和利用悬滴培养方式制备胚状体：高浓度干细胞+含甲基纤维素悬滴中=聚集生长为三维特征球状体(含有三胚层特征细胞)，即胚状体几天悬滴培养后，胚状体上个别区域发生“搏动”——原始心肌细胞小鼠胚胎干细胞起源心肌细胞可表示心脏各种结构蛋白、受体、转录因子等，其不一样属性心脏细胞心房样细胞、心室样细胞、浦肯野细胞等，能够用电生理方法检测出来上面心肌细胞移植入小鼠体内，整合入小鼠心脏组织，并参加血管形成，并继续增殖分化——再生医学心脏组织工程提供思绪不过除了组织相容性问题，来自胚胎干细胞心机细胞分化状态不够成熟，或移植入体内引发心律失常胚胎干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第14页胚状体细胞分散+特殊培养基=高百分比成骨细胞小鼠胚胎干细胞直接贴壁培养，分化成神经外胚层，移植入小鼠仍具活性，可整合入大脑，纠正一些神经变性疾病SAGM特殊培养基可诱导小鼠胚胎干细胞分化成肺泡ǁ型上皮细胞从胚胎干细胞诱导取得内胚层细胞系远远滞后于另两个胚层体外将胚胎干细胞诱导分化成各种类型细胞，在效率、成熟度、分离纯度、细胞功效性方面，依旧有许多亟待处理问题胚胎干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第15页组织干细胞是在组织内含有自我更新能力并能分化成一个或一个以上特化细胞原始细胞活体内组织干细胞存在于特定微环境，直接参加组织器官结构和功效动态平衡维持组织干细胞研究处于起步阶段，成功分离判定出造血干细胞等组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第16页造血干细胞造血干细胞hematopoiticstemcell,HSC概念提出于上个世纪40年代，因正常骨髓能够修复严重损伤骨髓1961年小鼠脾集落形成试验，证实了造血干细胞在体内存在一个造血干细胞(在骨髓占比例极少，增殖分化功效强大)能够重建整个造血系统组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第17页在哺乳动物个体发育中，造血干细胞最早存在于早期胚胎卵黄囊囊壁血岛→"主动脉-性腺-中肾"区→肝和脾→骨髓中(胚胎中后期和出生后)血岛仅是胚胎早期一个短暂性胚外造血场所，真正造血干细胞起源于"主动脉-性腺-中肾"区人造血干细胞表面标志有：CD34+、CD38－、Lin－、HLA－、DR－、Thy+、c-kit+、CD45RA－、CD71－等，出生后0.1%～0.5%CD34+细胞表示血管内皮生长因子受体2(VEGFR2，也称KDR)，其中CD34+KDR+亚群能生成全部血液淋巴细胞(淋巴系+髓系)组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第18页造血干细胞维持与分化方向跟造血微环境关系亲密哺乳动物骨髓中，一部分HSC存在于骨小梁骨内膜区，紧靠成骨细胞——成骨龛；另一部分HSC与血窦周围血管内皮细胞相连——血管周围龛成骨龛维持HSC数量，血管龛调控HSC增殖、分化、动员等临床是惯用骨髓移植或造血干细胞移植疗法，治疗白血病，美国医生E.D.Thomas因首创人类骨髓移植手术，取得1990年诺贝尔医学奖间充质干细胞间充质干细胞mesenchymalstemcell,MSC起源于胚胎中胚层间充质，能够分化为成体：骨髓、脂肪、外周血等，含有分化为中胚层全部细胞类型能力近十年，间充质干细胞是研究热点之一，已发展到临床应用依据国际细胞治疗学会标准，间充质干细胞基本特征是：组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第19页①能在塑料培养皿上黏附生长；②含有“三向分化”潜能，即脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞还要含有特征：细胞表面表示CD105、CD73、CD90等，不表示CD45、CD19/CD79、CD14/CD11b、HLA-DR等当前最大问题仍是缺乏特异性分子标志MSC代谢活跃，可分泌许多细胞外基质成份、许多细胞因子体外培养MSC含有免疫调整功效，主要表现为对T细胞功效抑制、树突状细胞成熟抑制、B细胞活化和增殖能力降低、NK细胞毒作用减低等当前从骨髓、脂肪组织、胎盘、皮肤、脐带血、脐带血管周细胞、牙髓、羊水、滑膜、母乳中，均能分离到MSC不一样起源MSC生物学特征存在一定差异组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第20页组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第21页神经干细胞近年研究发觉，多数成体哺乳动物神经系统侧脑室壁

室管膜下区(subventricularzone,SVZ)和海马齿状回

颗粒下区(subgranularzone,SGZ)有神经干细胞neuralstemcell,NSC存在原肠胚期出现神经上皮细胞，含有干细胞特征，是个体发育中最早出现神经干细胞神经上皮细胞可分化为放射状胶质细胞RGC，出生前RGC经过不对称分裂产生神经前体细胞、神经元、胶质细胞；出生后RGC对称分裂产生两种神经元和两种胶质细胞1992年BrentA.Reynolds和SamuelWeiss从成年小鼠侧脑室膜下区分离出能够不停增殖并含有分化潜能细胞体外生长神经干细胞特征性表示神经细胞中间丝蛋白，即巢蛋白（nestin），以及波形蛋白（vimentin）、胶质细胞原纤维酸性蛋白

（GFAP）等组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第22页体外培养NSC若撤去特殊生长因子（bFGF或EGF），NSC会分化成：星形胶质细胞、神经元、极少少突胶质细胞NSC主要存在于SVZ和SGZ两个区域，正常生理下，SVZNSC处于静息状态；损伤等病理情况下，NSC→过渡放大细胞→神经母细胞→沿胶质细胞形成轨道网络→嗅球SVZ和SGZ两个NSC微环境包含以下细胞组分：①星形胶质细胞；②基底膜以及伴随基底膜生成血管；③一些"胚胎"形态发生因子，在成年个体神经发生中发挥主要作用组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第23页肝干细胞肝脏起源于前肠内胚层，受到心脏间充质细胞分泌FGF因子作用形成肝脏原基；假如阻断来自心脏信号分子，则发育为胰腺肝原基中肝脏前体细胞，称为肝母细胞hepatoblast，表示干细胞特异性蛋白：甲胎蛋白和白蛋白伴随胚胎发育，肝母细胞侵入间质组织，形成肝内胆管细胞，表示γ-谷氨酰转肽酶γ-GT；或不接触间质组织，分化成肝细胞成体肝脏正常时细胞更替十分迟缓，当肝脏被切掉部分时，在半个月到一个月内由成熟肝细胞和胆管细胞增殖更替成体肝干细胞位于Hering管区域内，当肝脏受到广泛而慢性损伤造成肝细胞大量死亡时，可分化为肝细胞和胆管细胞，修复肝脏组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第24页精原干细胞精原干细胞spermatogonialstemcell存在于睾丸曲细精管基底膜，是分化程度最低一类原始细胞，是精子发生细胞基础，维持睾丸曲细精管结构和功效稳定与平衡1.精原干细胞是精子发生细胞基础精子发生全过程(在曲细精管内)：靠近曲细精管基底膜A型精原细胞→B型精原细胞→初级精母细胞→次级精母细胞→精细胞→精子小鼠A型精原细胞比较原始，B型精原细胞由A型分化而来将直接分裂形成初级精母细胞A型精原细胞有两种分裂方式：①形成两个子细胞；②细胞核分裂，细胞质分裂不全，形成胞质间桥组织干细胞医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第25页1个A型精原细胞经过连续细胞核分裂，形成链状体A型精原细胞(16或32合体细胞)，再连续正常有丝分裂6次，形成1024个B型精原细胞→初级精母细胞，经过减数分裂，产生4096个精细胞2.精原干细胞分化含有一个复杂调控机制从链状体A型精原细胞分裂成A1精原细胞，是精子生成中不可逆调控点，曲细精管支持细胞受损伤、缺维生素A、睾丸温度升高等，都会作用于此调控点，暂停精原细胞分化进程上述精原细胞分化暂停，在使用促性腺激素释放激素治疗后，分化重新开始组织干细胞不可逆调控点→医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第26页许多重大疾病都与干细胞相关，所以许多临床疾病治疗能够干细胞为基础干细胞与器官和个体衰老现在认为全部组织器官中都有干细胞，它们基本功效是维持组织器官结构和功效在生命过程中稳定和平衡衰老基本病理学特征：组织器官内稳定性减弱、损伤后修复能力减弱那么衰老细胞生物学基础：组织器官特异性干细胞衰老(功效紊乱)，增殖能力和损伤修复能力降低干细胞与医学医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第27页干细胞与肿瘤发生和复发肿瘤发生是组织细胞群失去稳定性表现；当前认为，肿瘤发生最大可能是组织干细胞发生突变组织干细胞总是处于高频增殖和分化状态，产生和积累突变可能性很高干细胞与组织再生组织器官受损时，机体开启修复机制，损伤组织局部有大量细胞增殖，伴有细胞分化和组织形成，使得损伤部位在空间结构上得到修复，功效恢复，这种现象叫组织再生损伤较轻邻近组织有一定增殖能力时，则邻近组织正常细胞分裂产生新细胞以修复干细胞与医学医学细胞生物学干细胞和组织的维持和再生第28页若损伤严重，且包括各种组织损伤，机体开启等级更低细胞群体增殖与分化每个组织都有处于不一样分化状态细胞群体，组织干细胞最低等级、然后是过渡细胞，最终是成熟细胞干细胞在疾病治疗中作用许多疾病是细胞功效缺点或器官受损伤造成，细胞治疗是将正常干细胞或