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第四章中药制剂含量测定

药品分析教研室中药制剂的含量测定第1页第一节含量测定目标与意义

在我国药品质量标准中,[判别]、[检验]和[含量测定]项目是判定中药制剂质量优劣标准。中药制剂判别是研究某种原料药或成份存在是否,从而判定药品真伪,而含量测定项目是研究某种成份含量高低是否符合要求来判定药品优劣。中药制剂含量测定是质量控制中一项主要指标。经过测定制剂中有效成份、毒性成份或一些指标性成份含量来衡量其制剂工艺稳定性和中药材质量优劣,以确保中药制剂质量,到达临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场需要。

中药制剂的含量测定第2页第二节含量测定样品处理

中药制剂样品基质和成份组成十分复杂,而且样品中被测成份往往含量较低,所以需要对样品进行各种处理,使其符合所选定分析方法要求。样品处理主要作用有:

将被测成份有效地从样品中释放出来,并制成便于分析测定稳定试样。

除去杂质、纯化样品,以提升分析方法重现性和准确度。

富集浓缩或进行衍生化,以测定低含量被测成份。衍生化不但可提升检测器灵敏度,还能够提升方法选择性。

使试样形式及所用溶剂符合分析测定要求。

中药制剂的含量测定第3页第二节含量测定样品处理

一、样品粉碎样品粉碎有两个目标:是确保含量测定所取样品均匀而有代表性,提升测定结果精密度和准确度;是使样品中被测组分能更加快地完全提取出来。粉碎时注意事项:不要粉碎得过细。样品粉碎得过细,在样品提取时,会造成过滤困难,所以可视实际情况进行粉碎过筛。防止污染样品。在粉碎样品时,要尽可能防止因为设备磨损或不洁净等原因而玷污样品,预防粉尘飞散或挥发性成份损失。过筛时,通不过筛孔部分颗粒决不能丢弃,必须重复粉碎或碾磨,让其全部经过筛孔。中药制剂的含量测定第4页第二节含量测定样品处理

二、样品提取对于中药材和固体制剂样品,在粉碎后,取粉末适量精密称定,首先用溶剂进行提取,使被测组分和一些共存组分从中溶解出来(前者必须完全溶出),与滤渣分离后,再对被测组分进行含量测定。下面介绍几个常见提取方法:冷浸法回流提取法连续回流提取法超声提取法超临界流体提取法中药制剂的含量测定第5页第二节含量测定样品处理

(一)冷浸法按所需准确度要求称取一定量样品置于带塞容器内,摇匀后放置,浸泡提取,溶剂用量为样品重量10~50倍,并称重。浸泡时间12~24小时,浸泡期间应注意经常振摇,浸泡后再称重,补足溶剂充分摇匀,浸泡后溶液,可取部分测定,也可全部测定。部分测定法(即等量法)是将浸泡后溶液,用适宜滤器过滤,精密量取一定量体积滤液,与一定重量样品相当,进行测定。此法不宜挥发性较大提取溶剂。全部测定法(即总量测定法)是将浸泡后溶液滤过,滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全,合并滤液及洗液,浓缩或蒸干得残留物用另一溶剂溶解,定量转入容量瓶,稀释至刻度,摇匀,进行测定。此法可克服部分测定法缺点,且提取时溶剂用量无须精密加入。中药制剂的含量测定第6页(一)冷浸法另外全部测定法中提取液浓缩蒸干,可依据详细情况采取以下方法:常压或减压蒸发,后者含有温度低、速度快,适于对热不稳定样品之优点;自然挥散或氮气流下吹干。适于小体积样品和挥发性溶剂,氮气流能预防氧化;冷冻干燥(常为水溶液),更适于热不稳定样品。冷浸法优点是操作简单,适于热不稳定样品,且提取杂质少。其缺点是费时、费溶剂。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第7页(二)回流提取法它是将冷浸法中带塞容器换成回流装置,用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取,其余操作方法同冷浸法。优点:1、提取效率高于冷浸法;2、且可缩短提取时间,每次提取时间为0.5~2小时,直至提取完全为止。缺点:1、提取杂质较多;2、该法对热不稳定或含有挥发性成份不宜使用。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第8页第二节含量测定样品处理

(三)连续回流提取法样品置索氏提取器中,利用遇热能够挥发溶剂进行重复提取(相当于总是在使用新鲜溶剂提取),普通提取数小时方可完全。优点:1)无需过滤,提取完全后取下虹吸回流管,就可回收溶剂,再用适宜溶剂溶解,定容,进行测定。2)提取效率高,所需溶剂少,提取杂质少,操作简便。缺点:受热易分解成份不宜使用。中药制剂的含量测定第9页第二节含量测定样品处理

(四)超声提取法

样品置适当容器中,加入提取溶剂,放入超声振荡器中进行提取。普通样品30分钟内即可完成,最多不超出1小时。优点:超声提取能使样品粉末更加好地分散于溶剂中提升提取效率和提取速度。(超声助溶作用)缺点:促使化学反应发生(如氧化还原反应、大分子化合物降解和解聚合作用等)。

对于由浸膏制成固体制剂,用上述方法提取时,通常是精密称取适量药粉于量瓶中,定量加适当溶剂提取后,以干燥滤纸过滤,弃去滤液,取续滤液(预防滤纸吸附或污染被测组分),按部分测定法测定。中药制剂的含量测定第10页第二节含量测定样品处理

(五)超临界流体提取法(Supercritical-fluidextraction,SFE)它是以超临界流体(惯用CO2)作提取溶剂,有效、快速提取固体或半固体中被测成份样品预处理新技术。超临界流体(SF)是指高于临界压力(Pc)和临界温度(Tc)时所形成单一相态,它既不是液体,又不是气体,而具以下特征:对样品组分溶解能力强。超临界流体(SF)密度与液体相近(如CO2超临界流体密度为0.3~0.9g/cm3),而其含有与液体相同溶剂作用;2)有利于样品中被测成份扩散进入SF中。SF粘度与气体相近,比液体略低2个数量级,扩散系数却比液体高1个数量级以上,使其含有良好传质性能;中药制剂的含量测定第11页3)

SF能使提取效率和提取速度大大提升。SF表面张力几乎为零,而较轻易渗透进样品基质空隙中,有利于SF与样品充分接触;4)同一个SF在不一样温度和压力下能够提取极性或分子大小都不相同化学成份。SF密度、粘度和扩散系数等都与温度、压力和流体组成相关。温度和压力稍高于临界点时,SF压缩系数最大,压力微小改变将造成较大密度改变,而控制密度就可控制SF对溶质溶解能力,当前也惯用升压力(即升密度)提取法进行分步提取。最惯用SF是CO2,它性质稳定,使用安全,价格低廉,临界点低(Tc=31℃和Pc=7.4MPa),易于操作。

第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第12页第二节含量测定样品处理

SFE含有优点:速度快萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节约溶剂、易于自动化,可防止使用易燃,有毒有机溶剂,能与色谱和光谱等分析仪器直接联用特点。SFE不但惯用于热不稳定成份或挥发性成份萃取,而且也越来越多地用于热稳定性成份萃取。缺点:对设备要求高。中药制剂的含量测定第13页第二节含量测定样品处理

三、样品分离净化(一)沉淀法原理:它是基于一些试剂与被测成份或杂质生成沉淀,分离沉淀或保留溶液以得到精制方法。这种方法须注意:1)过量试剂若干扰被测组分测定,则应设法除去;2)大量杂质以沉淀形式除去时,被测成份应不因产生共沉淀而损失;3)被测组分生成沉淀时,其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。中药制剂的含量测定第14页第二节含量测定样品处理

(二)蒸馏法原理:利用一些被测成份含有挥发性,可采取蒸馏法,搜集馏出液进行含量测定,或一些成份经蒸馏分解生成挥发性成份,利用分解产物(要求结构明确)进行测定。当前以水蒸气蒸馏法应用较多。1)它可分为共水蒸馏法(即直接加热法)、通水蒸汽蒸馏法和水上蒸馏法。如中药制剂中挥发油,一些小分子生物碱(麻黄碱、於碱、槟榔碱)及丹皮酚等,都可用蒸馏法提取和分离净化。2)为了使挥发性成份更完全地蒸馏出来,有时也可用盐析作用,即在蒸馏液中加入一定量无机盐,惯用NaCl、NaSO4、MgSO4等。中药制剂的含量测定第15页第二节含量测定样品处理

(三)液一液萃取法(LLE)

惯用两种LLE方法是有机溶剂直接萃取法和离子对萃取法。⒈直接萃取法原理:利用试样中被测成份与干扰成份在有机溶剂(萃取剂)中溶解度不一样,经过屡次萃取来到达分离净化目标。屡次萃取即使有利于提升萃取回收率和结果准确度,但屡次溶液转移等操作又会带来误差。有时对于组分复杂,含量低样品,因为样品数量多,屡次萃取费时等原因,只要每次测得回收率重现性好,常在可接收回收率前提下可采取单次提取。直接萃取法惯用溶剂有氯仿,二氯甲烷,乙酸乙酯和乙醚等。可依据被测组分疏水性相对强弱来选择极性适当溶剂,既确保被测组成充分萃取,又有很好选择性。对于弱酸性成份应调整水相pH≤Ka-2。而弱碱性成份应调整水相pH≥PKa+2(此处为其共轭酸pKa),以使弱酸、弱碱性成份主要以非离子化游离酸、或碱形式存在,而提升萃取率。在提取过程中也常利用中性盐盐析作用,如水相用NaCl饱和,使被测组分进入有机相而提升提取率。

中药制剂的含量测定第16页第二节含量测定样品处理

⒉离子对萃取法:其原理是在适当pH介质中,一些有机酸(碱)性物质形成离子与带相反电荷离子(也称离子对试剂)定量地结合成为弱极性离子对,而易溶于有机溶剂,使之萃取分离。它最适合于高度电离有机酸、碱化合物萃取(不能用直接法萃取),在中药制剂分析中主要用于生物碱(B)分析,其离子对试剂常为酸性染料(In-)如溴麝香草酚蓝(BTB)和溴甲酚绿(BCG)等,在水相中定量反应为BH+(水相)+In_(水相)BH+·In-(水相)BH+·In-(有机相)形成离子对BH+·In-惯用成氢键能力强氯仿或二氯甲烷提取。由上反应可知要求水相中生物碱和酸性染料都有较高离子化程度,所以必须注意水相pH和离子对试剂选择。通常生物碱与BTB形成1∶1离子对,最好在pH5.2~6.4提取,而二元碱形成1∶2离子对,最好在pH3.0~5.8提取(二元碱碱性弱,需要在较低pH下离子化后形成离子对)。若氯仿层中微量水份引发浑浊,可经过加入少许乙醇或久置分层变得澄清,也可分离有机相后加入脱水剂(惯用无水Na2SO4)或经滤纸滤过除去微量水份,另外液一液萃取时应尽可能防止发生乳化现象。中药制剂的含量测定第17页第二节含量测定样品处理

(四)色谱法

吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中净化分离方法,其操作方式有柱色谱,薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱,也称固相萃取或液—固萃取(LSE)含有设备简单,使用方便,快速,净化效率较高而最惯用,将在此做一介绍。LSE通常是指样品溶液加到装有适当固定相(净化剂)长5`~15cm,内径0.5~1cm色谱柱中,将被测成份保留于柱上,洗去杂质后,再洗脱被测成份进行测定,或者是使杂质强烈保留于柱上,直接洗脱被测成份进行测定。用这种选择性好而柱效较低方法进行样品净化分离,尤其适合用于一类总成份含量测定,也可将色谱柱流出样品深入用GC、HPLC、TCL分离后测定。LSE惯用净化剂(填料)有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。中药制剂的含量测定第18页第二节含量测定样品处理

⒈硅胶、氧化铝等:

它们是传统吸附剂,多以0.07~0.15mm(200~100目)颗粒1~5g用于样品净化处理,其作用机制为溶质在吸附剂表面极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂样品加到柱上时非极性或低极性杂质先被洗出众谱柱,再用适当极性溶剂洗脱被测成份,而强极性杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上,用于生物碱、苷类等测定。比如用UV法(吸收系数法)硅胶适合于分离中性或酸性化合物,强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上,依次用极性由小到大溶剂洗脱,则能够将杂质和被测成份分离。另外,硅胶也和下面所述硅藻土等一样,还可作亲水型填料使用,常见商品硅胶柱为Sep-pakSilica,通常以甲醇、水处理后上样。中药制剂的含量测定第19页⒉键合相硅胶:十八烷基键合相硅胶(简称C18或ODS)是惯用固体萃取剂,其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶,可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成份。也惯用于萃取,纯化水基质体液中憎水性药品。该类LSE普通操作程序为:1)柱活化。用2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质,再用0.5毫升水洗去柱中甲醇。2)上样。3)清洗。用2~5ml水清洗以除去弱保留亲水成份,如无机盐、氨基酸、亲水蛋白质、糖以及中等保留成份极性化合物、低肽等。4)洗脱。用2~5ml甲醇或甲醇-水洗脱大分子肽、甾体、较亲脂药品等强保留待测组分。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第20页⒊大孔树脂:它可分为极性和非极性型极性丙烯酰胺聚合物;非极性苯乙烯和二乙烯苯共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相同,经过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。比如在测定复方归芪剂中黄芪甲苷时,用大孔树脂除去水溶性多糖杂质,再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂主要特点是表面主动大,传质速率较高和含有不一样极性及适于吸附较大分子。树脂在使用前需要前处理:用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质,有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为1~2g,有时也用100~150mg来萃取血、尿中药品,操作程序类似ODS填料。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第21页第二节含量测定样品处理

⒋聚酰胺:它是惯用有机吸附剂,主要经过与溶质形成氢键而产生吸附作用。惯用于含酚、酸、醌类药品样品液净化分离,如测定黄酮时,用样品乙醇提取液上柱,水洗去部分杂质,以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。

中药制剂的含量测定第22页第二节含量测定样品处理

⒌硅藻土、纤维素:

它们为惯用亲水型填料,其原理为分配作用。填料作为支持剂,多以水基质液作为固定相,与水不混溶有机溶剂为流动相,较亲脂成份从固定相转移到流动相,而被洗脱,到达萃取目标。其萃取率较高(普通大于80%),无浓集作用,萃取液较纯净,但洗脱剂用量较大(普通大于5ml)硅藻土柱则用干柱直接上样,柱可再生。常见牌号为Extretut。纤维素柱使用与硅藻土柱相同。中药制剂的含量测定第23页⒍离子交换树脂:憎水基质离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂一些性质,所以对于在水中溶解度不大药品、洗脱剂中需含一定量有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中离子,预防组分分解,更惯用于萃取样品液中可离解化合物。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第24页第二节含量测定样品处理

另外,近年来发展起来固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技术有良好应用前景。SPME是一个无溶剂萃取技术,取样方式有直接取样和顶空取样。中药制剂的含量测定第25页(五)消化法

对样品进行有机破坏,惯用于中药制剂中重金属检验。惯用破坏方法有湿法消化和干法消化法。⒈湿法消化:依据所用试剂不一样,下面介绍三种常见消化方法。(1)硝酸—高氯酸法该法破坏能力强,反应较激烈,故进行破坏时,必须严密注意切勿将容器中溶液蒸干,以免发生爆炸。本法适合用于血,尿、组织等生物样品和含动植物药制剂破坏,经破坏后所得无机金属离子均为高价态,本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。(2)硝酸—硫酸法该法适合用于大多数有机物质破坏,无机金属离子均氧化成高价态,与硫酸形成不溶性硫酸盐金属离子测定,不宜采有此法。第二节含量测定样品处理

中药制剂的含量测定第26页第二节含量测定样品处理

(3)硫酸—硫酸盐法本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳,加入硫酸盐目标是为了提升硫酸沸点,以使样品破坏加速完全。同时预防硫酸在加热过程中过早地分解为SO3而损失。经本法破坏所得金属离子,多为低价态。本法惯用于含砷或锑有机样品破坏,破坏后得到三价砷或锑。湿法消化所用仪器,普通为硅玻璃或硼玻璃制成凯氏瓶(直火加热)或聚四氟乙烯消化罐(烘箱中加热)。所用试剂应为优级纯,水应为去离子水或高纯水,同时必须按相同条件进行空白试验校正。操作时应在通风橱内进行。

中药制剂的含量测定第27页第二节含量测定样品处理

⒉干法消化

本法是将有机物灼烧灰化以达分解目标,将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中,常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化,混匀后,先小火加热,使样品完全炭化,然后放入高温炉中灼烧,使其灰化完全即可。本法不适合用于含易挥发性金属(如汞、砷等,)有机样品破坏。应用本法时要注意以下几个问题:1)加热灼烧时,控制温度在420℃以下,以免一些被测金属化合物挥发。2)灰化完全是否,直接影响测定结果准确度。如欲检验灰化是否完全,可将灰分放冷后,加入稍过量稀HCl-水(1:3)或硝酸-水(1:3)溶液,振摇。若呈色或有不溶有机物,可于水浴上将溶液蒸干,并用小火炭化后,再行灼烧。3)经本法破坏后,所得灰分往往不易溶解,但此时切勿弃去。中药制剂的含量测定第28页第三节惯用定量分析方法

分类重量分析和滴定分析。化学分析法所用仪器简单,结果准确。主要用于测定制剂中含量较高一些成份及含矿物药制剂中无机成份,如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定不足,其灵敏度低,操作繁琐、耗时长,专属性不高,对于微量成份准确性不理想。中药制剂的含量测定第29页第三节惯用定量分析方法(一)重量分析法重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1、挥发法可测定含有挥发性或能定量转化为挥发性物质组分含量。如:①供试品干燥失重测定;②水分测定均属挥发法;③中药制剂分析中灰分及炽灼残渣测定等。2、萃取法是依据被测组分在互不相溶两相中溶解度不一样,到达分离目标。如①冰硼散中冰片含量测定;②地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定;③昆明山海棠片中总生物碱含量测定;④甘草浸膏中甘草酸含量测定即采取萃取法。3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物,测定其含量方法,适合用于制剂中纯度较高成份。如①西瓜霜润喉片中西瓜霜含量测定;②苦参片中苦参总碱含量测定;③复方元胡注射液总碱测定。中药制剂的含量测定第30页第三节惯用定量分析方法(二)滴定分析法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。1、酸碱滴定法适合用于测定中药制剂中所含有生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分含量。①直接滴定:对于K·C≥10-8酸、碱组分,可在水溶液中直接滴定。如:止喘灵注射液中总生物碱含量测定、颠茄酊中生物碱含量测定。②间接滴定或非水滴定法:如大山楂丸中总酸性物质含量测定、草乌注射液中生物碱含量测定等。2、沉淀滴定法主要用于生物碱、生物碱氢卤酸盐及含卤素其它有机成份含量测定。中药制剂的含量测定第31页第三节惯用定量分析方法3、配位滴定法包含EDTA法和硫氰酸铵法,在中药制剂分析中,用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂含量。如①万氏牛黄清心丸等含量测定就采取硫氰酸铵法;②牛黄解毒片中石膏含量测定。4、氧化还原滴定法适合用于测定含有氧化还原性物质,如含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成份中药制剂。如①磁朱丸中全铁含量测定采取铈量法;②牛黄解毒片中雄黄含量测定;③丹皮酚注射液中丹皮酚含量测。中药制剂的含量测定第32页第三节惯用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法该法是中药及其制剂含量测定一个惯用方法,含有灵敏度高,精度好和操作简便等优点。该法要求被测成份本身或其显色产物对可见—紫外光含有选择性吸收。按测定波长数目不一样分为单波长光谱法和多波长光谱法。

中药制剂的含量测定第33页第三节惯用定量分析方法(一)单波长光谱法

分类方法特点吸收系数法测定所配供试品溶液在要求波长吸收度,依据被测成份吸收系数(E1%1cm)计算其含量①对仪器要求高,使用该法时,应注意仪器波长、空白吸收校正,吸收度准确度检定和杂散光检验②无需对照品,方法简便对照品比较法在一样条件下配制对照品溶液和供试溶液,且使前者中所含被测成份量应为后者中被测成份量100%±10%,用要求波测定二者吸收度,则可计算出供试品中被测成份浓度或含量对仪器要求较高标准曲线法配制一系列不一样浓度对照品溶液(常为5个),在相同条件下分别测定吸收度,绘制A-C曲线,或求出其回归直线方程(相关系数r≥0.999),即得标准曲线。在相同条件下,测定供试品溶液吸收度,就可求得供试品中被测成份浓度或含量。①本法对仪器精度要求不高,有时标准曲线不经过原点,只要重现性好也可使用②该法在比色法中最惯用中药制剂的含量测定第34页第三节惯用定量分析方法(二)多波长光谱法(计算分光光度法)

供试品溶液中若有各种(两种或两种以上)组分共存,其紫外光谱彼此发生不一样程度重合时,则可经过测定各种波优点吸收度,依据吸收度加和性,采取适当数学处理方式进行多组分同时测定,或者用其排除共存组分干扰,测定其中某个组分。这就属于多波长光谱法范围。下面简明介绍用多波长法测定存在光谱干扰多组分样品中某个组分一些技术:双波长法(包含等吸收点法和系数倍率法)、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。中药制剂的含量测定第35页第三节惯用定量分析方法1.基本原理

(1).等吸收点法:设a、b分别为干扰组分和被测组分吸收曲线,λ2为测定波长(λS),λ1为参比波长(λR)。则有:①选择λ1和λ2两个基本条件:(i)干扰组分在λ1和λ2处应含有相同吸收度,即ΔAa=Aaλ2-Aaλ1=0,方便消除a干扰。(ii)待测组分ΔAb=Abλ2-Abλ1应足够大,方便提升测定灵敏度和准确度。通常λ2选在bλmax附近。此法可消除在λ1~λ2区间内,干拢组分吸收曲线为较宽吸收峰(谷)或为水平直线组分干扰。②定量公式△A=Aa+b–Aa+bλ1=△Aa+△Ab=△Ab=(Ebλ2-Ebλ1)·L·Cb=KCb即△A与Cb成线性关系,而与干扰组分浓度无关中药制剂的含量测定第36页第三节惯用定量分析方法(2)系数倍率法:

对于两组分(a和b),若干扰组分在所选两个波长区间没有吸收峰或谷,或虽有吸收峰或谷,但被测组分b△A值太小时,可考虑用系数倍率法测定b组分。该法也适合用于特殊三组分体系。对于两组分体系,选择λ1和λ2条件是:①干扰组分△Aa=K2Aaλ2-Aaλ1=0,即K2=Aaλ1/Aaλ2。②被测组分△Ab=K2Abλ2-Abλ1足够大。通常选择K2>1,Abλ2>Abλ1时,测定灵敏度较高。于是定量公式为△A=K2Aa+b–Aa+bλ1=△Aa+△Ab=△Ab=(Ebλ2-Ebλ1)·L·Cb=KCb即△A与Cb成线性关系,而与干扰组分浓度无关。

中药制剂的含量测定第37页(3)三波长法:当干扰组分吸收曲线上有三点成线时,就可用三波长法消除干扰。用相同三角形等比性质可推导出其定量公式为:△A=Aλ2-·C·L=KC三个波长选择有等吸收点法和计算法(见第三版分析化学第13章),其标准是经过粗略作图和准确计算,使干扰组分吸收曲线上三点成线,即△A=O,而被测组分△A足够大即可。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第38页(4)导数光谱法:该法又称微分光谱法,也是一个排除光谱干扰方法。其一阶至四阶导数光谱已均可在自动扫描分光光度计上直接扫描作出,而一阶导数光谱在手动分光光度计上测定也较轻易。因为导数光谱含有给出信息量大,谱带分辨率高和消除干扰能力强等优点,所以在测试工作中日益受到重视。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第39页第三节惯用定量分析方法从以上所述多波长光谱法原理可知,该法优点是可省去或简化样品预处理步骤,测定组成已知复杂样品,不过使用该法应慎重。首先因为中药及其制剂供试品溶液往往组成复杂,甚至干扰组分或阴性空白样品变动性大,所以,使得其方法适应性差,而只适应于同批样品或内控应用,当前极少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。再者,当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时,波长微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差。还有在实际工作中,因为测试条件改变,仪器精度与性能限制,多波长法不用吸收系数法,而采取标准品对比方法(惯用标准曲线法)来进行样品测定。中药制剂的含量测定第40页第三节惯用定量分析方法2.测定步骤①UV光谱测定:它是指分别测定被测组分和干扰组分溶液UV光谱于同一坐标系中(即重迭扫描)。被测组分光谱通惯用纯化学对照品配制成适当浓度溶液进行测定。对于干扰组分化学结构已知者,也可用纯化学对照品测定其UV光谱,而对于干扰成份组成尚不清楚者,通惯用阴性样品代替干扰成份来测定UV光谱。阴性样品分为缺含被测成份药材(即缺味)阴性样品和缺被测成份阴性样品。②波长选择:它是指依据各种测定方法原理选择一组适当波长。使得既能消除共存组分干扰,又能使被测组分测定灵敏度高(即回归直线方程斜率大)和测定误差小。中药制剂的含量测定第41页2.测定步骤③标准曲线绘制:通常按样品测定条件,用标准品配制5~7种不一样浓度溶液(必要时可加入干扰组分),分别测定各所选波优点吸收度,然后计算其回归直线方程(要求其相关系数r≧0.999)。④样品测定:配制被测组分浓度处于标准曲线线性范围内样品溶液(平行3~5份),测定各所选波优点吸光度。按回归直线方程和稀释度计算样品中被测组分浓度或含量。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第42页第三节惯用定量分析方法计算分光光度发特点:在测定组成已知复杂样品时,可省去或简化样品预处理步骤;中药制剂分析中,干扰组分或阴性空白样品变动性大,使得其方法适应性差,而只适应于一样品或内控应用;当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时,波长微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差;在实际工作中,因为测试条件改变及仪器与性能限制,多波长法惯用标准曲线法进行样品测定。中药制剂的含量测定第43页第三节惯用定量分析方法(三)差示光谱法(ΔA法)特点:①简易、快速、直接读数;②不需事先分离,即能消除干扰,还可提升精密度与专属性。方法:以试样空白作参比溶液,经过测定差示光谱中峰值(单波优点)和振幅值(两波优点)进行定量分析。基本原理:①能提供一个适当参比溶液;②在两种不一样介质环境或试验条件下,被测组分有不一样特征光谱,而赋形剂或其它共存组分光谱不变。定量依据:ΔA=A样—A参=(Ab2+Aa2)—(Ab1+Aa1)=Ab2—Ab1=(Eb2—Eb1)·Cb·L=KCb中药制剂的含量测定第44页第三节惯用定量分析方法三、薄层扫描法

薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱统计方法,又称薄层色谱扫描法(TLCS),对应仪器称为薄层扫描仪(ThinLayerChromatogramScanner)。薄层扫描法是用一定波长光照射在薄层板上,对薄层色谱中吸收紫外光或可见光斑点,或经激发后能发射出荧光斑点进行扫描,将扫描得到图谱及积分数据用于药品判别、杂质检验或含量测定。中药制剂的含量测定第45页第三节惯用定量分析方法(一)基本原理

薄层扫描法是指薄层色谱斑点色谱扫描,薄层色谱扫描是指固定波长,斑点移动,测定A-l或F-l曲线。依据薄层扫描测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。中药制剂的含量测定第46页第三节惯用定量分析方法1、薄层吸收扫描法基本原理:Kubelka-Munk理论及曲线。因为薄层板存在显著散射现象,斑点中物质浓度与吸光度关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点吸光度,说明了固定相散射参数SX对斑点中物质浓度与吸光度间关系影响,取得不一样散射参数SX时斑点A-KX理论曲线,即Kubelka-Munk曲线。光源:钨灯和氘灯;灵敏度:在200-800nm波长范围内选择适当波长进行测定,其灵敏度可达ng级;适用范围:适合用于在可见、紫外区有吸收物质,及经过色谱前或色谱后衍生成上述化合物样品组分。中药制剂的含量测定第47页2、薄层荧光扫描法基本原理:F=2.3K’I。ECL或F=KC光源:氙灯或汞灯。灵敏度:最低可测到10-50pg。适用范围:适合于本身含有荧光或经过适当处理后可产生荧光物质测定。Kubelka-Munk理论不适合用于薄层荧光扫描,无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时,用斑点荧光强度积分值(色谱峰峰面积)与斑点中组分含量代替上式中F与C进行运算。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第48页(二)薄层色谱规范化操作1、仪器与材料①薄层板;②涂布器;③点样器材;④展开箱(层析缸)⑤显色与检测仪器2、操作方法①薄层板制备;②点样;③展开;④检测;第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第49页第三节惯用定量分析方法(三)定量分析方法1、方法学考查新建薄层扫描定量方法必须进行方法考查,以说明新建方法可靠性,考查内容有工作曲线、定量结果精密度及准确度、统计检验等内容。中药制剂的含量测定第50页(1)工作曲线

①检验所选择散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校直为直线,不然,调整SX值再校正,直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。②考查工作曲线是否过原点,方便确定采取一点法或二点法定量。③确定点样量线性范围。既使采取曲线校直,也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线,所以需确定点样量上、下限。为降低定量误差,最好调整点样量,使供试品与对照品峰面积相靠近。为了克服薄层板间差异,外标法及内标法均应采取随行标准法,即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第51页第三节惯用定量分析方法(2)精密度考查

取同一供试品溶液,在同一块薄层板上以相同点样量平行点5点以上,展开后测定其峰面积,求算相对标准差(RSD),作为衡量定量分析结果精密度指标。RSD应小于4%。

式中:为n次测量平均值,S为标准差。中药制剂的含量测定第52页第三节惯用定量分析方法(3)准确度考查回收率是衡量定量方法准确度指标,惯用加样回收率(R)来衡量,其值应在95-105%之间,测量数据普通为5-6个。将加入纯品试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上,展开后进行薄层扫描,测定各斑点峰面积,计算各溶液中组分量,计算回收率(R)。中药制剂的含量测定第53页(4)统计检验统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量两组试验数据精密度或准确度(偶然误差或系统误差)间是否存在显著性差异,说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。统计检验包含F检验与t检验。

F检验即精密度差异检验,用以检验两组数据精密度或偶然误差是否存在显著性差异,普通为单侧检验。

t检验即准确度差异检验,用以检验两组测量数据平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证实两种方法测得均值不存在显著性差异时,则新方法能够代替旧方法,t检验普通为双侧检验。t检验与F检验详细方法参见分析化学相关论著,此从略。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第54页第三节惯用定量分析方法2、定量方法惯用定量方法有外标法、内标法、追加法(叠加法)及回归曲线定量法。(1)外标法外标法是薄层色谱扫描最惯用定量方法,方法简便,但点样必须准确。①外标一点法工作曲线经过原点(截距为零)时可用外标一点法定量。只需点一个浓度标准品溶液,与供试液同板展开,对比,测定组分含量,其计算公式为:C=F1·A式中:C为组分重量或浓度,A为测得该组分峰面积,F1为直线斜率或百分比常数。中药制剂的含量测定第55页②外标二点法工作曲线不经过原点时,只能用外标二点法定量,最少需点二种不一样浓度标准溶液(或一个浓度两种点样量),才能决定一直线,其计算公式为:C=F1A+F2式中:C、A同前,F1为直线斜率或百分比常数,F2为纵坐标截距,F1和F2值由仪器自动算出。

外标一点法、二点法只是指用一个或二种浓度标准溶液对比定量,为减小误差,同一薄板上供试品点样不得少于4个,对照品每一浓度不得少于2个;并调整标淮溶液浓度或供试品与标准溶液点样量,使其峰面积相靠近;且点样量必须准确,宜用定量毛细管点样。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第56页第三节惯用定量分析方法(2)内标法内标法是选一个纯物质作为内标物,并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中,计算供试品溶液中某组分含量定量方法。

内标物选择要求是:纯度合乎要求,展开后不得有杂质斑点,不然内标斑点峰面积将不能代表内标物量。内标物须为样品中所不含有成份。内标物不与其它斑点相重合,分离度合乎要求。为简化计算,内标物在标准溶液及供试品溶液中浓度应相等。中药制剂的含量测定第57页特点:1)在一定点样量范围内,内标法定量准确度与点样量无关。2)不易找到适宜Rf值纯品内标物,且溶液配制等操作较麻烦。方法:1)内标一点法:当工作曲线经过原点时采取内标一点法。内标一点法公式:2)工作曲线不经过原点时必须采取内标二点法内标二点法公式:

式中:C、Cis分别为组分及内标物浓度或重量,A、Ais分别为测得组分及内标物峰面积,F1为直线斜率或百分比常数,F2为截距,F1和F2由仪器自动计算并内存,可直接给出样品浓度或重量。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第58页(3)回归曲线定量法将不一样浓度(或不一样量)标准溶液与供试液点在同一块薄层板上,展开、扫描;由计算机对所测得峰面积及对应点样量进行线性或非线性回归;直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量方法;CAMAG系列薄层扫描仪即采取此方法。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第59页第三节惯用定量分析方法(四)影响薄层色谱分析主要原因1、样品预处理及供试液制备2、薄层色谱点样技术3、吸附剂活性与相对湿度影响4、溶剂蒸气在薄层色谱中作用5、温度影响中药制剂的含量测定第60页相对湿度(%)所需硫酸浓度(V/V)硫酸(ml)水(ml)326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相对湿度用硫酸溶液第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第61页第三节惯用定量分析方法四、气相色谱法

气相色谱法是以气体为流动相柱色谱分离分析方法。

特点:分离效能高、选择性好、灵敏度高,样品用量少及分析速度快等特点,兼具分离、分析功效,适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。

适用范围:适合用于热稳定性好易挥发性或可转化为易挥发性组分分析。中药制剂的含量测定第62页第三节惯用定量分析方法(一)基本原理

气相色谱是依据汽化后试样被载气带入色谱柱,因为各组分在两相间作用不一样,在色谱柱中移动有快慢,经一定柱长后得到分离,依次被载气带入检测器,将各组分浓度或质量改变转换成电信号改变统计成色谱图,利用色谱峰保留值进行定性分析,利用峰面积或峰高进行定量分析方法。中药制剂的含量测定第63页1、塔板理论

将色谱柱柱效用理论塔板数n或理论塔板高度H衡量,取决于区域宽度(σ、W1/2、W),其计算公式为第三节惯用定量分析方法n=

=5.54

=16

H=L/n适中:tR为组分保留时间,σ、W1/2、W分别为组分标准差、半峰宽和基线宽度。中药制剂的含量测定第64页若以调整保留时间tR’代替tR,则得到反应色谱柱实际柱效有效理论塔板数neff。neff=

=5.54

=16

Heff=L/neff可见,当tR一定时,峰越窄,则H越小,n越大,柱效越高,分离性能越好。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第65页2、速率理论速率理论研究了色谱过程中各种动力学原因对柱效(峰展宽)影响,提出了VanDeemeter方程式:H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分别为涡流扩散项、分子扩散(纵向扩散)项、传质阻抗项,从而解释了板高随载气流速而改变,且有最正确流速(Hmin)现象。速率方程式对于色谱分离条件选择含有指导意义,它能够说明色谱柱填充均匀程度、载体粒度、载气种类、柱温和固定液膜厚度对柱效、峰扩张影响。对于开口毛细管柱色谱,涡流扩散项A=0,故VanDeemeter方程式可简化为H=B/u+Cu,其传质阻抗小,柱长又远远大于填充柱,所以毛细管柱柱效要比填充柱高得多,其理论塔板数达105-106。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第66页3、分离度计算分离度是衡量分离效果指标,以相邻两色谱峰峰尖距对峰宽均值倍数表示,其定义式为:两峰基本分离,R≥1.5两峰完全分离。分离度影响原因很多,可用基本分离方程式概括以下:a、b、c分别为柱效项,柱选择性项和柱容量项。R==R=

abc第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第67页4、系统适用性试验按药典标准,中药制剂分析时,需按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,既用要求对照品对仪器进行试验和调整,以到达要求要求;或要求分析状态下色谱柱最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。(1)色谱柱理论板数n在选定条件下,注入供试品溶液或各品种项下要求内标物质溶液,统计色谱图,量出供试品主成份或内标物质峰保留时间tR和半峰宽Wh/2,按计算色谱柱理论板数。若测得理论板数低于各品种项下要求最小理论板数,应改变色谱柱一些条件(如柱长、载体性能、柱填充等),使理论板数到达要求。(2)分离度R定量分析时,为便于准确测量,要求定量峰与其它峰或内标峰之间有很好分离度,普通R≥1.5。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第68页第三节惯用定量分析方法(3)重复性取各品种项下对照溶液,连续进样5次,除另有要求外,其峰面积测量值相对标准偏差应小于2.0%,也可按各品种校正因子测定项下,配制相当于80%、100%和120%对照品溶液,加入要求量内标溶液,配成3种不一样浓度溶液,分别进样3次,计算平均校正因子,其相对平均偏差也应小于2.0%。(4)拖尾因子T为确保测量精度,尤其当采取峰高法测量时,应检验待测峰拖尾因子T是否符合各品种项下要求,或不一样浓度进样校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为:T=式中,W0.05h为0.05峰高处峰宽,d1为峰极大至峰前沿之间距离,除另有要求外,T应在0.95-1.05之间。中药制剂的含量测定第69页第三节惯用定量分析方法(二)试验条件选择在气相色谱分析中,为到达满意分离效果,需依据VanDeemeter方程式和分离度方程式选择适当分离条件,主要有固定相、柱温、载气流速等条件选择。1、固定相选择1)气—液色谱①固定液:按极性相同、化学官能团相同相同性标准和主要差异选择。②载体:普通为适宜粒度,经酸洗并硅烷化处理硅藻土。2)气—固色谱:固定相大多采取高分子多孔微球(GDX),用于分离水及含羟基(醇)化合物。中药制剂的含量测定第70页第三节惯用定量分析方法2、柱温选择选择基本标准:在使最难分离组分有符合要求分离度前提下,尽可能采取较低柱温,但以保留时间适宜及不拖尾为度。在实际工作中普通依据样品沸点来选择柱温,详细有以下几点:高沸点样品(沸点300-400℃),采取1-5%低固定液配比,柱温200-250℃。沸点为200-300℃样品,采取5-10%固定液配比,柱温150-180℃。沸点为100-200℃样品,采取10-15%固定液配比,柱温选各组分平均沸点2/3左右。气体等低沸点样品,采取15-25%高固定液配比,柱温选沸点左右,在室温或50℃下进行分析。对于宽沸程样品,需采取程序升温方法进行分析。但需注意是柱温要低于固定液最高使用温度。中药制剂的含量测定第71页3、载气选择主要从对峰展宽(柱效)、柱压降和检测器灵敏度影响三方面考虑。N2是最惯用载气;载气流速较低时,宜用N2;流速高时,宜用H2、He;较长色谱柱,宜用H2作载气;热导检测器应选取H2、He;氢焰检测器、电子捕捉检测器,普通用N2;普通控制载气流速高于其最正确流速。惯用载气流速为20-80ml/min。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第72页第三节惯用定量分析方法4、其它条件选择气化室(进样口)温度:气化温度取决于样品挥发性、沸点范围、稳定性及进样量等原因。检测室温度检测器温度普通需高于柱温,以免色谱柱流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温30℃左右或等于气化室温度。进样量在检测器灵敏度足够前提下,尽可能降低进样量,通常以塔板数下降10%作为最大允许进样量。对于填充柱,气体样品为0.1-1μl,液体样品为0.1-1μl,最大不超出4μl为宜。毛细管柱需用分流器分流进样,分流后进样量为填充柱1/10-1/100。另外,进样速度要快,进样时间要短,注意留针时间和室温影响,以准确控制进样量,以利于分离。中药制剂的含量测定第73页第三节惯用定量分析方法5、检测器热导检测器(TCD):通用型检测器,应用广泛,但灵敏度较低;氢焰离子化检测器(FID):应用最广泛,适合用于含碳有机物测定,载气多为N2。氮-磷检测器(NPD):专属性检测器,可用于中药及其制剂中农药残留量检测。电子捕捉检测器(ECD):专属性检测器,适合用于痕量电负性有机物—如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物分析。中药制剂的含量测定第74页第三节惯用定量分析方法(三)定量分析方法气相色谱惯用定量方法有内标法、外标法、归一化法等。1、内标法特点:为最惯用定量方法优点:可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来定量分析误差;缺点:样品配制较麻烦,有些内标物不易寻找。关键:选择适当内标物。适用范围:①适合用于样品全部组分不能全部流出众谱柱;②检测器不能对每个组分都产生信号;③只需测定样品中某几个组分含量时情况。中药制剂的含量测定第75页第三节惯用定量分析方法原理:选择一内标物,将一定量内标物加入到样品中,依据试样重量W和内标物重量Ws及待测组分和内标物峰而积Ai、As,求出待测组分含量。待测组分百分含量为:Ci%=式中fi、fs分别为被测组分和内标重量校正因子。在中药制剂分析时,校正因子经常不知,可采取药典方法测定校正因子再用内标法,或采取内标对比法测定。中药制剂的含量测定第76页第三节惯用定量分析方法(3)内标工作曲线法内标工作曲线法与外标法相同,只是在各种浓度标准溶液中加入相同量内标物,进样,以标准物与内标物峰面积比Ai/AS对Ci作工作曲线(或求回归方程)样品测定时也加入等量内标物,依据样品与内标物峰面积比AX/AS由工作曲线求得待测组分含量。中药制剂的含量测定第77页第三节惯用定量分析方法2、外标法关键:①进样量准确;②试验条件恒定。分类:1)工作曲线法:用一系列浓度对照品溶液确定工作曲线,在完全相同条件下,准确进样等体积样品溶液,计算其含量;2)外标一点法:当工作曲线截距为零时,可采取外标一点法定量,中药制剂的含量测定第78页3、归一化法关键:要求全部组分均要产生色谱峰。适用范围:通常只能用于粗略考查供试品杂质含量,普通宜用于微量杂质含量检验.①校正面积归一化法测定各组分含量。②面积归一化法计算:中药制剂的含量测定第79页第三节惯用定量分析方法高效液相色谱法(HPLC)是以经典液相色谱法为基础,引入气相色谱理论和试验方法。高压输送流动相,采取高效固定相及在线检测等伎俩发展而来分离分析方法,含有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。

适用范围:适合用于极性、非极性化合物,离子型化合物和高分子化合物分离分析。中药制剂的含量测定第80页第三节惯用定量分析方法(一)HPLC基本原理

HPLC与GC主要差异是流动相性质不一样。1、塔板理论用于计算理论塔板数及理论塔板高度,衡量色谱柱柱效。在系统适用性试验中,其理论板数不得低于各品种项下要求最小理论板数。H=L/n中药制剂的含量测定第81页第三节惯用定量分析方法2、速率理论在HPLC中流动相为液体。粘度大柱温低,扩散系数Dm很小,所以纵向扩散项B/u可忽略不计,其速率方程式为:H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分别是组分在流动相、静态流动相和固定相中传质阻抗系数。对于化学键合相色谱,“固定液”是被键合在载体表面单分子层,Cs≈0,则C=Cm+Csm。在HPLC中,当流动相线速度大于1cm/s时,可近似认为流动相流速与板高成直线关系,为兼顾柱效与分析速度,普通都采取较低流速。内径2-4.6mm色谱柱,多采取1ml/min。中药制剂的含量测定第82页第三节惯用定量分析方法(二)HPLC试验条件选择1、色谱柱选择依据被分离物质化学结构、极性和溶解度等原因进行选择。①大多数药品可用C18反相(ODS)柱加以分离测定;②也可选取正相分配色谱柱(氨基柱、氰基柱)或硅胶吸附色谱柱等;③解离药品可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定;④脂溶性药品异构体分离测定可采取硅胶吸附色谱柱。中药制剂的含量测定第83页第三节惯用定量分析方法2、流动相选择1)反相键合相色谱流动相惯用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药品非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃等用于分离疏水性物质缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特征化合物反相键合相色谱惯用流动相中药制剂的含量测定第84页第三节惯用定量分析方法2)正相键合相色谱

①常采取饱和烷烃(如正已烷)中加入一个极性较大溶剂作为极性调整剂(如异丙醚),经过调整极性调整剂浓度改变溶剂强度;

②常采取二元以上混合溶剂系统。中药制剂的含量测定第85页第三节惯用定量分析方法3、洗脱方式

等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定,使全部组分k值都处于这个范围内,适合用于组分数较少、性质差异不大样品。

梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相组成(如溶剂极性、离子强度和pH值等),适合用于分析组分数多、性质相差较大复杂混合物样品,从而使全部组分都在适宜条件下取得分离。中药制剂的含量测定第86页4、检测器

检测器特点最低检测限适用范围紫外检测器(UV或UVD)分为:①可变波长型②二极管阵列检测器①用于检测有外吸收物质;②灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱.10-7-10-12g用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧基化合物等荧光检测器(FD)①用于能产生荧光或其衍生物能发荧光物质;②灵敏度高于紫外检测器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等蒸发光散射检测器(ELSD)①属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相任何样品组分;②检测灵敏度较低,适适用于流动相能挥发色谱洗脱,不能用含缓冲盐流动相用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物中药制剂的含量测定第87页4、检测器

电化学检测器(ECD)用于能氧化、还原有机物质检测1×10-12g/ml适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等示差折光检测器(RID)①属通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测.②稳定性好,操作方便.③灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动影响大,不适合梯度洗脱10-8g/ml尤其适合于糖类检测化学发光检测器(CLD)①高选择性、高灵敏度新型检测器.②设备简单,本身发光,无需光源,价格廉价Pg级(10-12)用于分析微量脂质、核酸、生物胺等中药制剂的含量测定第88页5、HPLC前处理(1)流动相处理

①溶剂纯化选择专供色谱分析用“色谱纯”溶剂,分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析要求。因为不一样色谱柱和检测方法对溶剂要求不一样,有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水普通采取石英系统二次蒸馏水。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第89页②流动相脱气HPLC所用流动相必须预先除去其中空气,习称脱气,普通在临用前对流动相进行脱气,惯用脱气法有超声波振荡脱气、惰性气体(He)鼓泡吹扫脱气、抽真空加热法。③过滤过滤是为了预防不溶物堵塞流路和色谱柱入口处微孔垫片,所以应预先除去流动相中任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏,而惯用方法是过滤,采取0.45μm以下微孔滤膜过滤。滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。第三节惯用定量分析方法中药制剂的含量测定第90页第三节惯用定量分析方法(2)样品处理HPLC分析前需对样品进行预处理,方便将待测物质有效地从样品基质中释放出来,使样品形式及所用溶剂符合HPLC要求。①待测组分提取依据样品成份及组分性质选择适当提取方法和提取条件。②溶剂挥发对于液体样品或经处理后得到样品溶液,若待测物浓度在定量限以上,且溶剂对HPLC系统没有干扰,能够直接进样分析。但很多情况下需除去溶剂,浓缩甚至干燥样品,除去溶剂方法有:自然挥散或在氮气流下吹干,适合用于小体积样品和挥发性溶剂;减压蒸发,适合用于热不稳定样品;冷冻干燥,适合用于受热易分解破坏样品。③滤过样品溶液进样前,需用滤膜抽滤或针头滤器过滤,以有效除去样品溶液中悬浮物或部分大分子杂质。中药制剂的含量测定第91页第三节惯用定量分析方法其中液-液分配色谱是中药制剂分析中应用最广泛方法,依据固定相与流动相极性差异,分为正相色谱和反相色谱两类。正相色谱:流动相极性小于固定相极性分配色谱法,主要用于极性物质分离测定;反相色谱:流动相极性大于固定相极性分配色谱法,主要用于非极性、中等极性物质分离测定中药制剂的含量测定第92页第三节惯用定量分析方法化学键合相是将固定液官能团键合在载体上所形成固定相。含有化学性能稳定,热稳定性好,普通在pH2-8范围溶液中不变质,使用过程不流失,载样量大,适于梯度洗脱等特点,已广泛用于正相与反相色谱,离子抑制色谱,离子对色谱。药典中HPLC法所采取固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相色谱法称为化学键合相色谱法.现就中药制剂分析中最惯用键合相色谱法作一介绍。中药制剂的含量测定第93页第三节惯用定量分析方法(1)反相键合相色谱法反相键合相色谱法是当代液相色谱中应用最为广泛方法,占整个HPLC应用80%左右。反相色谱法普通采取非极性键合相,十八烷基键合相(简称ODS或C18)是最惯用非极性固定相,对于各种类型化合物都有较强适应能力;流动相通常以水为基础溶剂,再加入一定量能与水互溶极性调整剂,惯用有甲醇-水、乙腈-水系统。极性调整剂性质及其与水混合百分比对溶质保留值和分离选择性有显著影响,流动相极性增大,洗脱能力降低,溶质k增大,tR增大;反之,k与tR减小。调整流动相极性,可控制k值在所要求范围内(k=1-10),对于结构类似组分,极性大组分先出柱。中药制剂的含量测定第94页第三节惯用定量分析方法(2)正相键合相色谱法正相键合相色谱法应用不如反相色谱法普及,主要用于分离分析溶于有机溶剂极性及中等极性分子型物质。氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相是正相色谱惯用极性键合相,流动相通惯用烷烃(惯用正已烷)加适量极性调整剂组成。

中药制剂的含量测定第95页第三节惯用定量分析方法(3)离子对色谱法

直接将离子对试剂加入到流动相中,用以分离离子型或可离子化化合物方法作为离子对色谱法(PIC或IPC),该法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法,但近年来广泛应用几乎都是反相离子对色谱法,故本书只介绍反相离子对色谱法.①基本原理:以C18或C8键合相为固定相,用含离子对试剂有机溶媒-水溶液为流动相,用以分离离子型或可离子化化合物.②适用范围:适合用于有机酸、碱、盐分离;用离子交换色谱法无法分离离子和非离子混合物分离;在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸分析。

③缺点:离子对试剂价格比较贵.④分离条件选择:离子对试剂性质和浓度、流动相pH值及流动相中所含有机溶剂种类与百分比等。中药制剂的含量测定第96页第三节惯用定量分析方法i离子对试剂选择通常所选取离子对试剂电荷应与试样离子电荷相反。离子对试剂主要应用对象1、季铵类(如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基铵)强酸和弱酸(如磺酸染料、羧酸、磺胺类药品、水溶性维生素)2、叔胺类(如三辛基胺)磺酸盐等3、烷基磺酸盐(如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸盐)强碱和弱碱(如儿茶酚胺、罂粟碱、烟酰胺)4、高氯酸各种碱性物质(如有机胺、肽)5、烷基硫酸盐(如辛烷、十二烷基硫酸盐)应用对象同烷基磺酸盐中药制剂的含量测定第97页第三节惯用定量分析方法反相离子对色谱法中流动相pH值选择标准样品类型流动相PH值说明1、强酸(pKa<2)如磺酸染料2-7.4在整个pH范围内,样品可离解,实际pH值选择取决于共存其它组分类型。2、弱酸(pKa>2)如氨基酸、羧酸6-7.42-5样品可离解,其k值取决于离子正确性质样品离解被抑制,其k值取决于未离解样品性质。3、强碱(pKa>8)如季铵类2-8同强酸4、弱碱(pKa<8)如儿茶酚胺6-7.42-5样品离解被抑制,其k值取决于未离解样品性质样品可离解,其k值取决于离子正确性质。ii.流动相pH值控制

中药制剂的含量测定第98页第三节惯用定量分析方法iii.有机溶剂选择反相离子对色谱法中,甲醇-水、乙腈-水系统是最惯用流动相,流动相中所含有机溶剂百分比越高,组分k值越小。普通而言,样品组分疏水性及离子对试剂疏水性越强,所需有机溶剂百分比越高。中药制剂的含量测定第99页第三节惯用定量分析方法(4)离子抑制色谱法原理:因为离子对试剂价格较贵,对弱酸、弱碱分离,往往采取离子抑制色谱法。经过向流动相加入少许弱酸(惯用醋酸)、弱碱(惯用氨水)或缓冲盐(惯用磷酸盐及醋酸盐),调整流动相pH值,抑制样品组分解离,增加组分在固定相中溶解度,改进峰形,到达分离有机弱酸、弱碱目标,这种技术称为离子抑制色谱法(ISC)。特点:该方法简便、经济实用、分离效果好,在许多场所可替换离子对色谱法,但重复性较差是其缺点。适用范围:离子抑制色谱法通惯用于反相色谱中,适合用于3.0≤pKa≤7.0弱酸、7.0≤pKa≤8.0弱碱和两性化合物分离,以及它们与分子型化合物共存时分离。中药制剂的含量测定第100页第三节惯用定量分析方法离子抑制色谱法与离子对色谱法区分:

①离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂,调整pH值,抑制样品组分解离,使其以分子形式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂,并调整pH值使样品组分尽可能呈解离状态,使离子对试剂反离子与样品离子结合成中性离子对。②离子抑制色谱仅适合用于弱碱、弱碱分离,不适合用于有机强酸、强碱分离;而离子对色谱法对不一样强度酸、碱均适用。中药制剂的含量测定第101页第三节惯用定量分析方法(四)定量分析方法HPLC惯用定量方法有:外标法、内标法(内标对比法和内标标准曲线法)内加法。中药制剂的含量测定第102页第三节惯用定量分析方法六、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法是基于从光源辐射出含有待测元素特征谱线光,经过试样蒸气时被待测元素基态原子所吸收,由辐射谱线被减弱程度(即原子吸光度)来测定试样中该元素含量。该法能测定几乎全部金属元素和一些半金属元素,已广泛应用于中药制剂及中药材中重金属、毒害元素及微量元素检测。优点:灵敏度高、选择性和重现性好、干扰较少、操作简便快速、测定范围广等优点;

缺点:是标准工作曲线线性范围窄、测定不一样元素普通需用不一样光源灯且试验条件要求严格。中药制剂的含量测定第103页第三节惯用定量分析方法(一)基本原理一个原子可含有各种能级状态,在正常情况下原子是以其最低能态即基态形式存在,当吸收适当频率辐射原子由基态跃迁到激发态,其中原子由基态跃迁到第一激发态时所产生吸收线称为共振线。因为各种元素原子结构和外层电子排布不一样,不一样元素原子从基态激发到第一激发态时吸收能量不一样,各种元素共振线各有其特征性,称为元素特征谱线。对大多数元素来说,共振线是该元素全部谱线中最灵敏谱线,通常选择待测元素共振线作为原子吸收定量分析线。中药制剂的含量测定第104页第三节惯用定量分析方法(三)样品处理原子吸收光谱分析通常是溶液进样,被测样品需事先转化为溶液样品,预处理方法与通常化学分析相同,要求试样分解完全,在分解过程中应预防沾污和防止待测组分损失,所用试剂及反应产物对后续测定应无干扰。分解试样最惯用方法是用酸溶解和碱熔融,近年来微波溶样法取得了广泛应用。通常采取稀酸、浓酸或混合酸处理,酸不溶物质采取熔融法。无机试样如矿物类药品大都采取这类方法。有机试样通常先进行消化处理,以除去有机物基体,消化后残留物再用适当酸溶解。消化处理主要分干法消化和湿法消化两种,被测元素若是易挥发元素(如Hg、As、Cd、Pb、Sb、Se等),则不能采取干法消化,因为这些元素在消化过程中损失严重。中药制剂的含量测定第105页第三节惯用定量分析

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