GB/T 43159-2023 施马伦贝格病诊断技术（正式版）

ICS施马伦贝格病诊断技术国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会GB/T43159—2023 I Ⅱ 5生物安全措施 2 3 8附录A(规范性)病毒分离及血清中和试验相关溶液的配制 9附录B(资料性)荧光RT-PCR引物和探针序列信息 附录C(规范性)DEPC处理水的配制 附录D(规范性)阻断ELISA抗体检测相关溶液的配制 附录E(资料性)血清中和试验(噬斑减少中和试验)测定示例 IGB/T43159—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、中国检验检疫科学研究院。GB/T43159—2023施马伦贝格病(Schmallenbergdisease)是由施马伦贝格病毒(schmallenbergvirus,SBV)引起的反刍动物(牛、绵羊、山羊等)的一种非接触性传染的病毒性疾病，主要以成年动物短暂性临床症状(发烧、腹泻、产奶量减少等),以及新生动物先天性畸形为特征。施马伦贝格病毒属于布尼亚病毒科正布尼亚病毒属，主要通过库蒙等媒介昆虫传播，也可通过子宫内感染垂直传播，尚无证据显示该病毒能传染人。该病于2011年11月首次在德国西部城镇施马伦贝格被检测出并得名，随后在欧洲大部分地区暴发流行。本文件的实施将对提高我国施马伦贝格病的诊断和监测水平、及时采取防控措施、保护家畜健康和产业发展起到重要的作用。本文件的制定参考了世界动物卫生组织《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2022年英文版),并结合了我国相关技术研究新成果。1GB/T43159—2023施马伦贝格病诊断技术本文件规定了施马伦贝格病(Schmallenbergdisease)的临床诊断、样品采集调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB19489实验室生物安全通用要求本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。CMC:羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect)Ct:循环阀域(cyclethreshold)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein)HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonicacid]HRP:辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR:反转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)SBV:施马伦贝格病毒(schmallenbergvirus)TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯2GB/T43159—20235生物安全措施规定执行。6临床诊断感染本病。6.2.1成年活畜。成年绵羊和山羊一般无症状，但怀孕母羊感染后流产率和后代先天性畸形率增加，可见死胎、早产胎、木乃伊胎；成年牛无症状或出现轻微临床症状，包括一过性体温升高当易感动物出现上述部分或全部临床症状和病理变化时，可初步判定为疑似病例。确诊应进一步采样送实验室诊断。7样品采集与处理少于2mL,密封后冷藏保存。7.2.1组织样品：取无菌采集的组织样品约1g,剪碎后加入10mL灭菌的0.01mol/LpH7.4PBS(含3GB/T43159—2023青霉素1000IU/mL,链霉素1000μg/mL),置于研钵中充分研磨，制成1:10悬液，4℃浸提4h。3000r/min离心5min,取上清液，标记编号后立即进行SBV病原检测或冷冻储存备用。7.2.3无抗凝剂添加全血：按常规方法制备血清，标记编号后立即进行SBV抗体检测，或冷冻储存SBV病原检测(羊水)或抗体检测(心包液),或冷冻储存备用。7.2.5精液：新采集精液可用灭菌PBS做4倍稀释，商品化精液不用稀释，标记编号后立即进行SBV病原检测或冷冻储存备用。8.1.1.2CO₂细胞培养箱。8.1.2.10.01mol/LPBS,按照附录A的A.1配制。8.1.2.250%甘油-磷酸盐缓冲液，按照A.2配制。8.1.2.3青霉素，浓度为10000IU/mL。8.1.3.1制备单层细胞：按照常规方法将仓鼠肾细胞(BHK-21)或非洲绿猴肾细胞(Vero),或昆虫细胞(KC)分装在25cm²细胞培养瓶中，每瓶分装细胞悬液5mL,细胞浓度维持在2×10⁵个/mL～3×10⁵个/mL,37℃(哺乳动物细胞)或27℃(昆虫细胞)培养48h。8.1.3.2接种细胞：7.2.1或7.2.2处理后的组织样品上清液或血浆接种已长成单层的BHK-21或Vero,或KC细胞，每份样品接种2瓶细胞，另外设对照细胞2瓶。接种前，先倒去细胞瓶中营养液，加入1mL处理后的病料液，室温静置30min,然后再加4mL细胞维持液。细胞对照瓶不接种样品，倒去营养液后加5mL细胞维持液，37℃(哺乳动物细胞)或27℃(昆虫细胞)培养。每日在倒置荧光生物8.1.3.3盲传：如接种细胞第1代5d后未出现CPE,收获细胞/病毒液按8.1.3.2所述方法再接种生长48h的单层细胞进行盲传，即1mL第1代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃(哺乳动物细胞)或27℃(昆虫细胞)培养。如此盲传3代。8.1.4结果判定出现CPE,可初步判为病毒分离阳性。进一步鉴定需将出现CPE的细胞培养液，用荧光RT-PCR4GB/T43159—2023方法进行核酸检测和分析。8.2荧光RT-PCR方法8.2.1.1荧光PCR扩增仪。8.2.2.1引物和探针(序列见附录B)。8.2.2.3商品化荧光RT-PCR试剂盒(含一步法荧光RT-PCR反应缓冲液，酶混合液、参比荧光ROX8.2.2.4阳性对照：体外转录法制备的SBV的RNA片段或经灭活处理的SBV细胞培养物。8.2.2.5阴性对照：BHK-21等正常细胞对照或SBV阴性动物EDTA抗凝血或DEPC处理水。采用核酸提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，超过2h应置于-20℃冰箱保存。——12.5μL的2×一步法荧光RT-PCR反应缓冲液；——1.0μL的正向引物(10μmol/L)、1.0μL的反向引物(10μmol/L)、0.5μL的探针(10μmol/L);——1.0μL的酶混合液；——0.5μL的参比荧光ROXⅡ;——3.5μL的DEPC处理水。盖紧PCR管盖，瞬时离心后，置荧光PCR扩增仪内进行扩增。每次检测应设置阳性对照和阴性对照。42℃反转录30min;95℃预变性10min;95℃变性15s,64℃退火20s,72℃延伸30s,共45个标准阳性对照Ct值应≤30且有特异性扩增曲线，标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，试5GB/T43159—2023被检样品Ct值<38且有特异性扩增曲线，判为SBV核酸阳性。无Ct值或Ct值>40,判为SBV核酸阴性。若38≤Ct值≤40且出现特异性扩增曲线，则判为可疑。可疑样品应重新检测，若重新检测结果无特异性扩增曲线或无Ct值或Ct值>40则为SBV核酸阴性，若Ct值≤40且有明显扩增曲线则判为SBV核酸阳性。8.3.1.2恒温培养箱。8.3.2.3酶标抗体：HRP标记山羊抗小鼠IgG。材料上拍干。8.3.3.4样品检测：向孔内加入不稀释的待检血清，每孔100μL,同时设置阳性血清和阴性血清对照，室温(22℃~25℃)孵育60min。其中阳性对照、阴性对照血清做2孔重复。8.3.3.6加特异性单抗：用稀释液将SBVN蛋白特异性单克隆抗体稀释至工作浓度(1:32000),每孔加入100μL,室温(22℃~25℃)孵育60min。8.3.3.7按8.3.3.2冲洗酶标板。8.3.3.8加酶标抗体：用稀释液将HRP标记山羊抗小鼠IgG稀释至工作浓度(1:32000),每孔加入100μL,室温(22℃~25℃)孵育60min。68.3.3.12在酶标仪450nm波长处读值。8.3.4样品抑制率计算方法样品抑制率按公式(1)计算： (1)式中：OD₄50-s——待检血清样品在450nm波长处的OD值；OD₄50-Nc——阴性对照血清在450nm波长处的平均OD值。8.3.5试验成立条件阴性对照OD₄₅0-Nc值>0.7;且阳性对照OD₄5o-Pc值与阴性对照OD₄5o-Nc的比值<0.3,说明试验条件成立。8.3.6结果判定在试验成立的前提下，待检样品PI值≤40%,判为SBV抗体阳性；待检样品PI值>50%,判为SBV抗体阴性；40%<待检样品PI值≤50%,判为结果可疑，对结果可疑样品，应进行复检。如样品PI值≤40%,判为SBV抗体阳性；待检样品PI值>50%,判为SBV抗体阴性；仍为40%<待检样品PI值≤50%,则判为阳性。8.4血清中和试验(噬斑减少中和试验)8.4.1主要仪器和设备8.4.1.312孔、96孔细胞培养板。8.4.2主要试剂和材料8.4.2.3细胞基础培养液、完全培养液和维持液。8.4.2.510%中性福尔马林溶液。8.4.2.72.3%结晶紫溶液。8.4.3试验程序8.4.3.1.1用无血清细胞维持液在96孔细胞板上将SBV病毒液做10-¹~10-¹¹稀释。7GB/T43159—20238.4.3.1.2取长满单层Vero细胞的12孔细胞培养板，吸出培养液，将稀释好的病毒液各取250μL移至12孔细胞培养板第1孔～第11孔，第12孔仅加入无血清细胞维持液作为阴性对照。轻轻振荡细胞培养板后放置细胞培养箱37℃培养4h。8.4.3.1.3向每孔内加入1mL～1.5mL预热的CMC覆盖液，37℃培养6d。8.4.3.1.4向每孔中加入1mL10%中性福尔马林溶液，并在室温下作用3h。温下作用5min～10min。8.4.3.1.6用流动冷水冲洗板孔。将细胞培养板在吸水纸上拍干，计数每孔观察到的噬斑数量。测定噬斑形成单位(PFU)。8.4.3.2.1将待检血清56℃水浴30min灭活。用无血清细胞维持液在96孔板上将待检血清做1:10～1:1280连续倍比稀释，终体积为(含200个PFU)稀释的病毒液，轻轻振荡平板，并在细胞培养箱37℃培养8.4.3.2.3将血清/病毒混合液分别接种长满单层Vero细胞的12孔板的第1孔～第8孔，并做适当标8.4.3.2.4向每孔内加入1mL～1.5mL预热的CMC覆盖液，37℃培养6d。8.4.3.2.5向每孔中加入1mL10%中性福尔马林溶液，并在室温下作用3h。下作用5min～10min。8.4.3.2.7用流动的冷水冲洗板孔。将细胞培养板在吸水纸上拍干，计数每孔观察到的噬斑数量。8.4.4结果判定8.4.4.1计算中和抗体滴度以Reed和Muench氏法计算(示例见附录E):距离比例按公式(2)计算：式中：X———高于90%的噬斑抑制百分数；Y——低于90%的噬斑抑制百分数。中和抗体效价按公式(3)计算：NA=10IgX-0.3PD (3)式中：NA——中和抗体效价。对照均成立，以90%抑制噬斑减少为滴定终点，血清抗体滴度大于或等于1:10的标本判为阳性。8GB/T43159—20239综合判定9.1临床判定为疑似病例的易感动物，经8.2检测为SBV核酸阳性的，判定为施马伦贝格病确诊病例。新生幼畜疑似病例的血液经8.3或8.4任一项检测为SBV抗体阳性的，判定为施马伦贝格病确诊病例。9.2临床无明显特异症状的同群或具有流行病相关性易感动物，采集血液或组织样品经8.2检测为SBV核酸阳性的，应经8.1分离出病毒方可判定为SBV感染。9.3临床无明显特异症状的非免疫动物经8.3或8.4任一项检测为SBV抗体阳性的，判定为该动物曾经感染过SBV。9GB/T43159—2023(规范性)病毒分离及血清中和试验相关溶液的配制A.10.01mol/LPBS(pH7.4)(KH₂PO₄),加去离子水溶解至1000mL,调节pH至7.4,103kPa高压蒸汽灭菌30min,室温保存。菌30min。室温或4℃保存。A.3细胞完全营养液和维持液A.3.1MEM基础营养液称取9.5gMEM干粉和2.2g碳酸氢钠(NaHCO₃),加去离子溶解至1000mL,充分混匀，过滤除A.3.2200mmol/L谷氨酰氨溶液称取2.923g谷氨酰氨(L-glutanin),加去离子水配制成100mL的溶液。A.3.3细胞完全营养液(pH7.2)取900mLMEM基础营养液加100mL灭活胎牛血清混合，配制成1000mL的溶液，加入青霉素至终浓度100IU/mL,加入链霉素至终浓度100μg/mL,加入谷氨酰氨至终浓度2mmol/L,4℃保存A.3.4细胞维持液(pH7.2)1000mLMEM基础营养液，加入青霉素至终浓度100IU/mL,加入链霉素至终浓度100μg/mL,加入谷氨酰氨至终浓度2mmol/L,4℃保存备用。A.4羧甲基纤维素(CMC)覆盖液于磁力搅拌器上加热搅拌至CMC溶解。稍微冷却后，加入10mL1mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及5mL胎牛血清，用细胞维持液定容至终体积500mL。继续磁力搅拌30min,4℃保存。GB/T43159—2023(资料性)表B.1列出了荧光RT-PCR引物和探针序列信息。表B.1荧光RT-PCR引物和探针序列信息引物/探针名称引物序列(5物序列针)节段SGB/T43159—2023(规范性)DEPC处理水的配制取1mLDEPC加入去离子水至终体积1000mL,充分混匀后将瓶盖拧松，于37℃放置过夜，高压灭菌。室温或4℃保存备用。GB/T43159—2023(规范性)阻断ELISA抗体检测相关溶液的配制称取1.59g碳酸钠(Na₂CO₃)、2.93g碳酸氢钠(NaHCO₃),将其溶于约950mL去离子水中，调节pH为9.6后，定容至1000mL。D.2洗涤缓冲液/特异性单克隆抗体稀释液/酶标抗体稀释液(含0.05%吐温-20的0