TSPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病综合防控技术规程

ICS01.040.65CCSB15/19湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN003-2024豆科蔬菜主要病毒病综合防控技术规程CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetableViralDiseases2024-06-05发布 2024-06-05实施湖南省植物保护学会 发布T/SPPHN003-2024T/SPPHN003-2024前 言本文件是根据GB/T1.1-20201本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。IT/SPPHN003-2024T/SPPHN003-2024PAGEPAGE10豆科蔬菜主要病毒病绿色综合防控技术规程范围本标准适用于豇豆、蚕豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的综合防控。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB4285 农药安全使用标准GB/T8321 农药合理使用准则术语和定义GB/T35333和界定的以及下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。综合防控技术IntegratedPreventionandControlTechnology豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蚕豆、菜豆和豌豆等蔬菜。VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、专一性或广谱性等特性。DifferentialHost对特定病原物有特殊反应或表现特定症状的植物称为鉴别寄主。PositiveControl凡是确定可以出现预期结果的处理，称为阳性对照。NegativeControl凡是确定不会出现预期结果的处理，称为阴性对照。BlankControl凡是不加处理因素的处理，称为空白对照。发生流行规律豆科蔬菜病毒病主要由黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobaccomosaic（Broadbeanwilt（MilkvetchdwarfCMVTMV和BBWV均可由蚜虫或汁液接触传播，而MDV主要由蚜虫以持久方式进行传播。病害诊断病害田间诊断生物学检测具体方法和检测结果见附录B。血清学检测具体方法和检测结果见附录B。分子生物学检测具体方法和检测结果见附录B。防治原则防治方法农业防治种植抗病品种根据各地栽培条件选用抗病品种。留种设立无病留种田，在留种田淘汰病株，减少毒源，从无病优质的良种株上采集种子。种子消毒播种前将种子在清水中浸泡（蚕豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸种10%磷酸三钠溶液中浸种20～30min30%合理轮作尽量避免与豆科作物重茬栽培，选用空茬地或倒茬地，与非豆科作物合理轮作。田间卫生清除田间及周边杂草，加强肥水管理，及时摘除病叶，拔除病株。物理防治使用防虫网大棚豆科蔬菜选择60目以上的防虫网。色板诱杀对于矮杆豆科作物（豌豆、蚕豆等）可采用色板诱杀蚜虫，在田间放置30cm×40cm的诱虫黄板300~450块/hm2，呈棋盘式均匀插置田间，黄板底部略高出植株顶端10~20cm左右，黄板粘满害虫后及时更换。药剂防治药剂使用应符合GB4285和GB8321的相关规定。病毒病防治病毒病防控以预防为主，当病情指数≥5%时，选择使用高效、低毒、低残留农药进行防治。由于7~10蚜虫防治抓好早治蚜连续治蚜，减少虫媒传毒。当蚜株率≥5%时，优先采用植物源农药，严禁使用禁用农药或高毒农药，防治蚜虫常用药剂的用量及用法见附录C。加强病虫测报，实行统防统治建立防治档案在田间调查豆科病毒病发生情况时，具体调查内容参见附录D。附录A（资料性附录）图A1）。图A1豇豆病毒病症状（图A2）。图A2蚕豆病毒病症状（A3）。图A3菜豆病毒病症状图A4豌豆病毒病症状图A4豌豆病毒病症状图A4豌豆病毒病症状附录B（规范性附录）豆科蔬菜病毒病生物学、血清学检测病毒生物学检测病毒摩擦接种方法（200~400目（也可直接将金刚砂加在研磨液中病毒的保存与测定-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接种至病毒敏感植物上，观察其症状（见图B1、图B2、图B3）。图B1CMV分离物接种至克氏烟上的症状：系统花叶。图B2TMV分离物接种至本氏烟上的症状：系统花叶，皱缩卷曲。图B3BBWV分离物接种至普通烟上的症状：枯斑。病毒的血清检测植物叶片称重后，按重量体积比1:10~1:50（g/ml）加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm离心3min；取100μL上清点入已包被抗体的酶标板中，室温孵育2h；吸出样本上清液，每孔点入300μLPBST，清洗（4~5次）；吸干酶标孔中PBST，点入100μL的碱性磷酸酶标记的二抗，室温孵育2h；吸出样本上清液，每孔点入300μLPBST，清洗（7~8次）；吸干酶标孔中PBST点入300μL1mg/ml的显色底物PNPP，避光反应30min，待阳性对照显色明显后，使用酶标仪OD450nm读数，为阴性对照读数2倍以上的为阳性，2倍以下的为阴性，见图B4。图B4TMV、CMV和BBWV分离物的DAS-ELISA检测结果分子生物学检测RNA采用硅粒吸附法提取植物总RNA0.11mLGB500μL研磨液，加100μL105rpm离心10300μL150μLμLμL10rpm离心1min，倒去上清；加500μL洗涤液（WB:无水乙醇=1:1）洗涤，6000rpm离心1min，倒掉上清，ddH2O150μL，70℃温育4min，1min后将离心管盖打开，随即盖上；13000rpm离心3min，取上清100μL，-20℃保存。由于MDV为DNA病毒，需进行DNA提取。每份样品选取10g叶片，将叶片置于液氮中，充分研磨DNA提取试剂盒操作步骤提取BufferLP1和RNaseBuffer000rpm离心5BufferLP3000rpm离心1minBuffer000rpm离心11100μLBufferGE，静置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。RT-PCR反转录以硅粒吸附法提取的总RNAB1病毒反转录体系试剂体积TotalRNA7μLRandomPrimer1μL2×TSReactionMix10μLRIEnzymeMix1μLgDNARemover1μL总体积20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，-20℃保存。反应引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特异性引物见表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特异性引物病毒名称（前引/后引）引物序列片段长度TMVTMV-FCGGTCAGTGCCGAACAAGAA690bpTMV-RATTTAAGTGGASGGAAAAVCACTBBWVBBWV-FGGCTTGATGGAGGAAGATG1202bpBBWV-RTTGACCAAGCATGTACCTCCMVCMV-FATGGACAAATCTGRATCWMCC764bpCMV-RCTGGATGGACAACCCGTTCMDVMDV-FTCTCTCTATAAAAGCTGTTA576bpMDV-RAAATGATTGTTGATTTCATT(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)反应体系TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR和MDV的PCR反应体系见表B3表B3TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR和MDV的PCR反应体系试剂体积10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP1.6μL引物F1.0μL引物R1.0μL酶0.3μLcDNA1.0μL加水定容至20μL反应程序TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR反应程序和MDV的PCR反应程序见表B4表B4TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR反应程序和MDV的PCR反应程序病毒名称反应程序TMV94℃预变性4min，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min，35个循环；72℃延伸7min。BBWV94℃预变性4min，94℃，45s；56℃，45s；72℃，1min30s，35个循环；72℃延伸7min。CMV94℃47MDV94℃预变性4min，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min，35个循环；72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳检测，取5µL扩增反应物与2µLSYBRGreenӀ染料、3µLloadingbuffer混匀，点入样孔内。电泳缓冲液1×TAE适量，100V，电泳30min。目的片段的克隆与分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒，结果见图B5、图B6、图B7和图B8。图B5豆科作物携带BBWV的检测图B6豆科作物携带CMV的检测B7TMV的检测B8MDV的检测病毒分子生物学检测所用试剂如下：（1）GB溶液4.0M 异硫氰酸胍0.2M NaAc(pH5.2)25mM EDTA(pH8.0)1M KAc2.5%(W/V) PVP-40（2）10%NLS将1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。WB溶液1mM EDTA(pH8.0)20mM Tris-HCl(pH7.5)10mM NaCl6M NaI0.15M Na2SO3硅溶液将60g二氧化硅溶于500mL水中，静置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，静置5h，倒掉440mL上清，用HCl将剩下的60mL沉淀调pH值至2.0，高压灭菌后，200μL/管分装，-20℃保存。附录C（规范性附录）药剂防治病毒病及传毒害虫一览表表C1药剂防治病毒病及传毒害虫一览表防治对象防治农药使用剂量施用方法使用次数防治时期病毒病20%盐酸吗啉胍·乙酸铜可湿性粉剂600g/hm2喷雾视病情严重情次，间隔7~10d喷一次。病情指数≥5%0.5%菇类蛋白多糖水剂3L/hm2喷雾2%宁南霉素水剂14.4L/hm2喷雾24%混脂·硫酸铜水乳剂1.5L/hm2喷雾沼泽红假单胞菌悬浮剂3L/hm2喷雾嗜硫小红卵菌悬浮剂3L/hm2喷雾蚜虫10%溴氰虫酰胺可分散油悬浮剂45g/hm2喷雾视病情严重情次，间隔7~10d喷一次。虫株率≥5%50%呋虫胺可湿性粉剂90g/hm2喷雾10%氟啶虫酰胺水分散粒剂60g/hm2喷雾25%噻虫嗪水分散粒剂50g/hm2灌根连灌2~3次，每