DB45-T 2755-2023 百香果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法

45法I 2 2 2 2 2 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 6 6 6 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定黄小娟、王丹、劳苏海、莫薇、黄鹂、郑美玲、官月香、韦仁矿、韦东、黄芳、刘守廷。1百香果品种鉴定技术规程SSR分子标记法repeat，SSR）分子标记法进行百香果品种鉴定的原理、材料和试剂、仪器设备、引物序列信息、操作本文件适用于广西壮族自治区行政区域内基于SSR分子标记的百香果品种SSR指纹数据采集和品种GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）具有所用SSR位点上不同等位变异的特性，用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖4缩略语PCR：聚合酶链式反应(Polymeras2DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAc不同品种百香果的基因组成不同，其基因组中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR）：）：）：）：6.2.11液氮（N2ρ=0.81g/cm3。6.2.12三氯甲烷（CHCl3ρ=1.50g/cm3。）：6.2.1640％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acry）：Tris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mmol/LMgCl2、溶于70mL一级水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。3条件下灭菌20min。一级水在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。），），），49操作步骤9.1样品采集放入0℃~8℃保温箱中，带回实验室，于-18℃及以下条件保存。提取溶液（6.2.3涡旋振荡混匀后于65℃水浴45min～60min，期间每隔15min颠倒离心管混匀；加入500µL的三氯甲烷（6.1.12颠倒混匀，12000r/min离心3min，转移上清液约0.5mL至新离心管中，加入等体积（即0.5mL）预冷至约4℃的无水乙醇（6.1.13颠倒混匀，-18℃下静置1h，--），后72℃下延伸7min。9.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测9.4.1.1聚丙烯酰胺凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，在封口处注入1％琼脂糖溶液（6.2.5让其凝固密封。5将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液（6.2.7小心拔下样品梳。用加样器吸取1µL不同引物PCR产物，加入样品孔中，同时在同一泳选用的电压梯度为1V/cm～5V/cm，2×TaqPlus预混试剂（6.1.19）的蓝色指示带从上到下分别到达9.4.1.3银染显色9.4.2毛细管电泳检测甲酰胺（6.1.15）。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置于冰浴中，冷却10min～15min。67序号℃1反向：GAGAACAATGATGTCACT23正向：TCATTAACATCGTAA反向：AATTCGACAAGATTTACT4反向：CTATTTTGTGATC5正向：GTCACTATCATCCCA反向：AGGTAAAATTAATA6反向：CACTTGTTTCACT7正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’8正向：CTCCATATCAGATTA反向：CTCAAATAAAAAC9反向：CAAATTATGATAAGAAACTT正向：ACAGAAAAGAAAGAT反向：TTCAGTATCCAACTGAACA正向：TGGTAGTCAATCAGA正向：TGGAATGTGATTTG8序号℃反向：GCAGACATTTCCT反向：CTGGGTTTT