基因芯片课件

基因芯片目录概述原理基本步骤制备方法应用优缺点展望一、概述

基因芯片（genechip,又称DNA芯片，DNA微阵列），是生物芯片的代表。

背景：

随着人类基因组计划（

Humangenomeproject

）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。

基因芯片技术就是顺应这一科学发展要求的产物。

概念：基因芯片技术是将大量已知序列的核酸片段有规律地固定在玻璃片、硅片、尼龙膜等各种固体支持物上形成分子阵列，然后与用荧光标记过的核酸样品进行杂交，当样品与基因芯片上对应位置的核酸探针发生互补配对时，可以通过荧光强度来确定探针位置，获得与探针互补的核酸序列，从而获知样品信息。分类

有机基因芯片载体基质无机基因芯片

基因表达谱芯片使用功能测序芯片诊断芯片

高密度芯片探针数量中低密度芯片

二、原理

基因芯片的原理是将特定的已知核酸序列的cDNA片段或寡核甘酸片段有规律地固定在固相支撑物(硅片、陶瓷或玻璃片等)表面作为基因探针，根据碱基互补配对原则，与用荧光或放射性同位素标记过的DNA或RNA样品进行杂交，通过检测系统的杂交信号进行分析，可以高效快速地检测靶基因的存在量及其变异性。根据需要制备探针利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。固定于支持物上的探针,与标记样品的碱基不互补则探针与样品不能进行杂交通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。正常

高表达

低表达通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析从而得到基因的表达水平检测原理以及相关工具

由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupleddevicecamera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。

此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。工具有：

（1）激光扫描荧光显微镜：氩离子激光器，分辨率高，图像质量好；

（2）激光扫描共焦显微镜：共焦技术，灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约12万美元；

（3）采用了CCD相机的荧光显微镜：扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用；

（4）传感器：实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模DNA芯片。标记物主要有：荧光标记物（最常用）和生物素标记物荧光标记杂交信号的检测方法荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物，并具有很好的空间分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时，分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率，而在传统的显微镜是很难做到的，这便为DNA芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。

生物素标记方法中的杂交信号探测以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。三、基本步骤

生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。生物芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。1、芯片准备：先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在芯片上。（芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。）2、样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反应：杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。4、芯片信号检测：杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。

基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micrototalanalyticalsystem）或称缩微芯片实验室（laboratoryonachip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。四、基因芯片的制备

有原位合成法和直接点样法两种，原位合成法一般用于制备基因芯片，直接点样法既可以用于制备基因芯片也可以用于制备蛋白质芯片。1、原位合成法，是指将数量众多的电极固定在固相支持物上，电极上具有生物亲和性的多孔空间，用于合成DNA片段所需的4种单核苷酸可以进入电极上的多孔空间，在电极上合成DNA片段，原位合成法又可分为光导原位合成法与原位喷印合成法。（1）光导原位合成法

光导原位合成法是由美国昂飞公司研发的，利用光敏保护基将碱基单体的5‘端羟基保护起来，之后固相支持物上的光敏保护基与1个核苷酸单体连接，如此循环直到合成完成。光导原位合成法制备探针之间的距离为5~10µm，1㎝2可以容纳106个探针，这种方法的优点是步骤简单、合成速度快且合成探针量大，缺点是合成的探针长度不是很长。（2）原位喷印合成法

喷印合成法原理与传统的DNA固相合成原理一致，形式类似于喷墨打印，有多个喷印头及墨盒，墨盒里面装有4种碱基的液体。喷印头可以在整个载体上任意移动，根据载体上不同位点探针的序列要求将特定的碱基喷印在特定的位置。2、直接点样法，是指将人工合成的寡核苷酸片段直接点在固相支持物上。

直接点样是将合成好的探针、cDNA、基因组DNA片段通过人工或高速点样器直接点在固相支持物上。根据点样方式不同可将直接点样法分为接触点样、非接触点样。对于直接点样法来说，点样器的好坏直接决定了基因芯片的探针密度及结合强度，点样装置质量的衡量指标有点样速度、点样稳定性、点样密度等。五、基因芯片的应用

在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。丁香通上关于基因芯片的应用：/experiment/430/586/587/1_index.htmAffymetrix的芯片基因表达芯片：GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0全转录组基因表达芯片（HTA2.0）基因分型芯片：AxiomHumanOrigins基因分型芯片Axiom中国人基因分型芯片细胞遗传学芯片：CytoScanHD细胞遗传学检测芯片Affymetrix是基因芯片技术的先驱和基因组学研究领域的领导者，致力于研发并提供能够在细胞、蛋白和基因水平对生物系统进行多重和平行分析的创新技术，同时致力于促进研究成果的转化，创造更美好的生活。/

OncoScan芯片

Affymetrix全新的OncoScan芯片利用独特的分子倒置探针（MolecularInversionProbe,MIP）技术，能够快速经济地分析来自福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixedParaffin-embedded,FFPE)样本的少量的高度降解的DNA，让实体瘤癌症分析向前迈进了一大步。

基因芯片在生物研究中的应用主要体现在：1、基因表达分析2、DNA测序3、发现新基因4、病原检测5、绘制图谱1、基因表达分析

通过基因芯片检测生物不同发育阶段或病原体不同致病阶段的基因表达情况，可以研究基因的功能及病原的致病机理。

Girke等运用基因芯片对拟南芥种子发育过程进行了研究，发现通过基因芯片筛选到的拟南芥2600个基因中,有25％的基因在种子中的表达量是叶子及根的2倍。zhou等制备了水稻基因组表达芯片，经过低能N+光束处理后，每30个与组蛋白相关的基因中有1个基因表达上调，每38个溴结构域蛋白基因中有1个基因表达上调，1个基因表达下调。luan等制备了包含有13319个探针的鸡基因芯片，在2周龄小鸡感染沙门氏病菌前后，检测到了588个差异表达基因，其中276个是已知功能基因，并且通过实时荧光定量PCR鉴定验证了4个基因。2、DNA测序

利用基因芯片进行DNA测序过程如下:：将包含已知核酸探针的DNA芯片与待测的DNA样品进行分子杂交，在DNA芯片表面可检测到荧光信号，通过分析形成的图谱获知样品序列。对已知序列进行重测序是DNA芯片的主要应用之一，重测序指的是某种群或物种完成基因组测序后，对个体或群体的差异性分析，需要进行再测序。

DNA芯片测序具有快速、高效等优点，应用前景广阔，主要测序方法有：

SBH：sequencingbyhybridizationCSH：con-tigousstackinghybridizationCSH技术测序的长度大于SBH测序的长度

在测定植物与病原物基因组突变等方面，基因芯片是强有力的工具。

参照已知基因序列，在载体上合成大量寡核苷酸探针，与待测样品进行杂交，两者匹配程度越高，杂交信号越强。基因芯片技术测序的准确率较高，国外学者利用包含大量探针的微列阵对人类线粒体基因组的序列进行测定，准确率达99％。3、发现新基因

利用基因芯片技术发现新基因在医学上有极其重要的意义，尤其是致癌基因的发现。研究人员利用基因芯片技术，筛选微生物诱导后的成年果蝇差异表达基因，发现数百个未知功能的新基因。

Yao等采用基因芯片技术，设计了乳腺癌比较基因组杂交阵列，分析了与扩增区域有关的每个基因表达水平，发现2个致癌新基因，分别为H2AFJ、EPS8。4、病原检测

DNA芯片技术作为一种强有力的检测工具，在临床诊断、环境检测、食品安全检测等领域得到了广泛运用。

周钧等利用日本血吸虫基因芯片对江西省#湖南省的钉螺进行检测，结果显示，江西省、湖南省感染性钉螺检出率为100%。

张锦海等根据疟原虫高度保守的基因片段制备了疟原虫诊断、分型基因芯片，能快速诊断出疟原虫及其分型，对疟疾的防治具有重要意义5、绘制图谱

采用基因芯片探针阵列与相应的生物信息方法可以进行基因文库作图。张新建等用基因芯片技术研究了水稻白叶枯病菌的侵染过程，并分析其基因表达谱，发现侵染过程中有5个基因发生了明显变化。赵宝存等采用基因芯片技术获得小麦基因的差异表达图谱，并分析了在不同盐胁迫时间下小麦根部基因表达的变化，包括盐诱导、盐抑制表达基因。此外：

由于心血管系统生理和病理过程相关的信号转导系统是一个综合的调控网络，需要借助复杂系统的研究理论和方法来完成。基因芯片技术利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微阵列，可同时采集到信号转导网络中多个节点的基因表达信息，因而能更好地满足研究心血管系统信号转导网络的要求.因此，应用基因表达芯片可全面研究与某一心血管疾病相关的基因群，有利于发现更多的心血管病基因表达水平上的标志物。六、基因芯片的优缺点

优点：快速、高效、自动化。

基因芯片不仅能在早期诊断中发挥作用；与传统的检测方法相比，它可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多种疾病的检测；利用基因芯片，还可以从分子水平上了解疾病。基因芯片的这些优势，能够使医务人员在短时间内掌握大量的疾病诊断信息，找到正确的治疗措施。除此之外，基因芯片在新药的筛选、临床用药的指导等方面，也有重要作用。不足之处：

尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。此外价格昂贵，只有比较大的药厂或研究所能负担得起，所以仍未广泛使用。（1）样品制备：在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题，这包括MosaicTechnolo