T-SHAAV 018-2024 犬瘟热病毒抗体检测 酶联免疫吸附法

ICS11.220B41SHAAV团体标准T/SHAAV018—2024犬瘟热病毒抗体检测酶联免疫吸附法DetEctionofantibodiesagainstcaninedistemperVirusEnzymelinkedimmunosorbentassay2024-04-10发布2024-04-10实施上海市畜牧兽医学会发布T/SHAAV0182024前言 II1范围 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5原理 6试剂和材料 7仪器设备添加规格 8样品的采集与前处理 9操作方法 10结果判定 附录A(资料性)溶液配制 lT/SHAAV0182024前言本文件按照GB/T1.12020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心、上海市嘉定区农业技术推广服务中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心、上海市松江区农产品质量安全中心。本文件主要起草人:杨显超、赵洪进、王建、向蒙、李鑫、冯桂丹、杨德全、鞠厚斌、沈海潇、陶田谷晟、陶军、王晓旭、吴秀娟、李守富、卢春光、翁永刚、刘健、金一春、曹向英、殷方芝、葛菲菲、夏炉明、李凯航、周锦萍、唐燕婷、张玉杰、唐聪圣。本文件首批承诺执行单位名单:上海市动物疫病预防控制中心、上海市嘉定区农业技术推广服务中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心、上海市松江区农产品质量安全中心。llT/SHAAV0182024犬瘟热病毒抗体检测酶联免疫吸附法本文件规定了犬瘟热病毒抗体间接ELISA检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品采集、操作步骤和结果判定等要求。本文件适用于犬血清中犬瘟热病毒抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NYT541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineserumAlbumin)iELISA:间接酶联免疫吸附试验(IndirectenzymeLinkedImmunosorbentAssay)HRP:辣根过氧化物酶(Hydrogen-peroxideoxidoreductase)OD:光密度(opticalDensity)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-BufferedsalineBuffer)TMB:四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine)5原理酶联免疫吸附试验:将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。6试剂和材料6.1.1除非另有说明,所用试剂均为分析纯,试验用水符合GB/T6682的要求。6.1.2包被抗原:犬瘟热病毒H蛋白(灭活纯化),-20C保存。6.1.3酶标抗体:HRP标记的鼠抗犬IgG,-20ec保存,使用前解冻,置4℃备用。3T/SHAAV0182024614阴性对照血清:犬瘟热病毒抗体阴性的血清615阳性对照血清:犬瘟热病毒抗体阳性的血清616洗涤液:配制方法按附录A中A1617抗原包被液:配制方法按附录A中A2618封闭液:配制方法按附录A中A3619底物:配制方法按附录A中A46110终止液:配制方法按附录A中A56111样品稀释液:配制方法按附录A中A662耗材62196孔板622移液器吸头6232mL离心管7仪器设备72高速冷冻离心机73振荡器74恒温培养箱75微量移液器:05μL10UL2YL20ul20UL200μL和200YL1000μL76冰箱:2ec8C和20ec以下8样品的采集与前处理样品的采集保存与运输按照NYT541执行实验室生物安全要求按照GB19489的规定82血液样品的采集与处理压迫犬或猫肘部使前臂头静脉怒张绷紧头静脉两侧皮肤采样针头斜面朝上呈15角由远心端向近心端刺入静脉血管见有血液流出时缓慢抽取1mL左右的血到采血管中无菌分离血清装入2mL离心管中4C保存备用9操作方法91用抗原包被液将犬瘟热病毒H蛋白稀释至5μg'mL取100μL加入到酶标板4℃孵育过夜92洗板三次拍干酶标板上残留的液体按照200YL/孔的量加入封闭液37℃封闭2h93将待检血清用样品稀释液作1:100稀释并充分混匀94将包被板固定于板架上剩余的包被板放入密封袋中保存4T/SHAAV018202495每次试验每板应设阳性对照阴性对照各2孔加入100μL不需稀释的阳性对照阴性对照其余每孔加入稀释后样品100UL置37℃孵育30min96甩净孔中液体将洗涤液注满每孔甩净拍干反复洗涤3次每孔加工作浓度的酶标抗体100μL置37ec孵育30min97甩净孔中液体同上洗涤3次拍干后各孔加底物100μL置37℃避光15mi每孔加入终止液100μL轻微震荡微孔板以混合均匀98加入终止液5~10min内用酶标仪读取450nm吸光值10结果判定101试验成立的条件阴性对照平均OD45m值≤03阳性对照平均OD45m值>10证明试验成立否则试验结果无效需重新试验102计算待检血清S/P值S/P-(OD45m样品OD45nmn阴性对照)(0D45nmn阳性对照OD45m阴性对照)103结果判定:1021样品S/P值<035判定为CDV抗体阴性1022样品S/P值≥04判定为CDV抗体阳性102304>样品S/P值≥035判定为CDV抗体可疑判为可疑样品可重复检测次如果检测结果仍为可疑可判为阳性5T/SHAAV0182024附录A(资料性)溶液配制将表A.1的试剂依次加至容积为1000mL容器中,充分溶解即成。表A.1洗涤液配制表单位:目试剂名称用量氯化钠(Nacl)8.02氯化钾(kcl)0.20十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)3.87磷酸二氢钾(KH2PO4)A.2抗原包被液将表A.2的试剂依次加至容积为1000mL容器中,充分溶解即成。表A.2抗原包被液配制表单位:g试剂名称用量碳酸钠(Na2co3)1.59碳酸氢钠(NaHCO3)2.93A.3封闭液在100mL洗涤液中加入5gBSA即可。A.4底物溶液A.4.1碳酸盐-柠檬酸盐缓冲液将表A.4.1的试剂依次加至1000mL体积的容器中,充分溶解即成。表A.4.1碳酸盐-柠檬酸盐缓冲液配制表单位:试剂名称用量十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)71.6无水柠檬酸(COH807)19.2A.4.20.75%H202T/SHAAV0182024取30%H2021.25mL,加入蒸馏水,使总体积达到50mL。A.4.3四甲基联苯胺(TMB)母液取200mgTMB溶解于100ml无水乙醇中。-20℃保存。A.4.4底物溶液(临用时配制)表A.4.4底物溶液配制表单位:ml试剂名称用量0.1mol/LPH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液9.5TMB母液0.50.75%H20242此底物液对光敏感,应避免强光照射,现配现用。A.5终止液将22.2mL浓硫酸(H2SO4)加入到17