转基因植物的遗传特性与表达调控

关于转基因植物的遗传特性与表达调控一、转基因植物中外源DNA的整合特性1、外源DNA的整合位点和拷贝数（1）整合位点：转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过程整合到核基因组中，目前普遍认为，转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的,外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体，也可以插入一条染色体的任何位点或没有固定的插入位点，但往往对转录活跃区域具有优先插入特性。（2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。第2页,共25页，星期六，2024年，5月2、外源DNA结构对整合的影响

外源DNA结构分为四种类型：单链线形DNA、单链环形DNA、双链线性DNA及双链环形DNA。四种结构中单链线状DNA研究较多，一般认为单链DNA可以通过有效的不正常整合参与同源染色体序列的重组，研究认为单链DNA在单链完全变成双链之前已发生重组。此外Bilang等（1992）研究了导入烟草的DNA结构（线形和环形）的重组效率，结果表明线性单链DNA同环形单链DNA相比，其抗性愈伤组织数目要高于后者，说明线性DNA的整合效率要高于环形DNA。第3页,共25页，星期六，2024年，5月3、转化后整合位点的DNA结构变化

保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。

Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插入进行了研究，提出了外源DNA整合模型，他们认为：（1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失，最多79个核苷酸；（2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA，这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似；（3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其作用。

此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。第4页,共25页，星期六，2024年，5月4、转化方法对整合外源基因结构的影响

尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入，由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。（1）T-DNA转化的外源DNA结构变化农杆菌介导转化细胞中T-DNA结构完整，整合位点稳定，多数情况下在25bp处与植物DNA连接，整合后的外源基因结构变异少，但外源DNA也会出现结构变化，表现为T-DNA的串联和截短现象。

T-DNA串联：通常有5-20个拷贝的T-DNA的首尾相联，在大多数整合事件中，T-DNA可以在无选择压的情况下串联起来。

T-DNA截短：也是T-DNA转化时较多发生的结构变化，可能是由于T-DNA两侧各有一个25bp的边界类似序列。截短是在转移和整合过程中产生，由于T-DNA区内‘框类似’序列的存在，被用作引导T-DNA转移和整合的次级识别位点，从而代替正常情况下的25bp右边界序列，所以正常的有边界序列被截短。截短在共整合载体中比二元载体系统更易发生。第5页,共25页，星期六，2024年，5月（2）裸露DNA直接转化的外源DNA结构变化

采用裸露DNA直接转化时，整合的外源DNA往往出现复杂的杂交图谱，在转化当代及子代中常出现DNA环化、甲基化、片段分离和丢失等现象。在DNA直接转化中供体DNA容易在整合过程中发生各种结构变化和修饰，而且植物靶DNA序列也可在供体DNA整合过程中发生重排。第6页,共25页，星期六，2024年，5月5、位点特异重组（1）位点特异性重组系统

遗传重组分为3类：同源重组，转座和位点特异性重组，也称定位重组。同源重组发生在两个具有一定程度同源性的DNA分子之间或同一分子的两个同源性区域，它们相互重组。转座和位点特异重组的共同点是重组只发生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶来识别某一种DNA序列，而造成重排。二者的区别在于转座重组中，识别位点之间的DNA片段被转位插入到另外的位点，是DNA合成过程中伴随而发生的DNA断裂、转移和插入。而定位重组并不涉及DNA的净合成，在两个识别位点之间的DNA片段并不转移到基因组中的另一地方，这段DNA是在重组酶所识别的位点上进行重组、交换而被切除或发生倒置，该定位系统越来越多地应用于转基因植物中，以改造基因重排，去除不需要的筛选基因、激活或缺失某一表达基因。第7页,共25页，星期六，2024年，5月

目前发现的有4个定位重组系统，Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix。（2）位点特异性重组的作用机制

以Cre/lox为例加以说明，Cre来源于噬菌体P1，P1基因组中有1029bp的一段DNA，编码343氨基酸的38.5kDa的蛋白质，即一种重组酶。该酶在离体系统中以含loxP基因座的DNA序列为底物，高效地使线状、环状甚至超螺旋DNA发生重组反应，而产生功能。当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发生倒位，如果loxP不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定点重组。第8页,共25页，星期六，2024年，5月四类定位重组系统的分子重组程序分以下几步：A重组酶识别并结合重组位点的反向重复序列，每一反向重复序列结合一个重组酶；B在重组酶作用下，两个重组位点发生通向联会；C联会后两个重组位点的DNA一条链在重组酶的作用下断裂，并通过3′-PO4与重组酶的Tyr（酪氨酸）的游离-OH相连，保存了DNA断裂时的能量；D重组酶的断裂链与另一位点处断裂的5′-OH端相连，此时两DNA链的一条分别与对方交叉相连；E交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体；FHolliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。第9页,共25页，星期六，2024年，5月第10页,共25页，星期六，2024年，5月第11页,共25页，星期六，2024年，5月第12页,共25页，星期六，2024年，5月（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用

A控制转基因整合的拷贝数；

B可导入多个基因进入植物基因组；

C使目标基因重排；

D激活目标基因；

E定点转化植物；

F基因克隆第13页,共25页，星期六，2024年，5月二、转基因植物中外源DNA整合的遗传效应1、位置效应：在同一实验中获得的不同转化植株，外源基因的表达水平存在很大差异，这主要是由于外源基因在染色体上插入的位点不同而造成，这种现象称为位置效应。外源基因插入位点的位置效应也可引起转基因的失活，其原因可能是插入位点周围的DNA序列组成起重要作用。位置效应的明显表现是外源基因的整合位置对表达频率的影响。目前的转化方法通常导致转基因在宿主细胞中随机整合，因此位置效应是转基因表达不一致的主要原因之一。第14页,共25页，星期六，2024年，5月2、重组效应：

转基因容易被植物基因组存在的重组和修复系统识别，致使转基因不同程度的重排，转基因同源和非同源重组必然引起DNA的易位，缺失、重复等一系列结构变化。外源基因结构变化甚至不同位点碱基序列的变化对其表达的影响不同，表现为DNA重组的多样性：正效应、负效应及无影响等状态。第15页,共25页，星期六，2024年，5月3、转基因沉默

外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称为转基因沉默，转基因沉默是遗传工程走向应用的潜在障碍，成为基因工程中的重要问题。（1）转基因沉默的机理概述

20世纪80年代后期，基因沉默主要涉及到转基因与转基因之间或转基因与内源基因之间的互作，认为沉默的来源于多拷贝的同源DNA序列，这些序列指蛋白质编码区，启动子或两者皆有。已提出三种基因沉默模型：顺式失活；即多拷贝，串联基因的导入常常导致倒位或直接重复引起失活；反式失活；可以看作顺式失活的副产品，指因顺式作用失活的转基因可以作为一种沉默子，使独立DNA分子上的同源靶基因引起相似水平的甲基化和失活；共抑制或有义抑制，涉及到一个转基因与一个同源的内源基因或两个同源的转基因之间的协同沉默。三种模型均涉及核酸互作而引起的变化，如DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。转基因沉默主要发生在两个阶段，一是发生在转录水平；二是发生在转录后水平上。第16页,共25页，星期六，2024年，5月（2）转录水平的基因沉默

A转基因及其启动子甲基化；B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默；

C同源基因间的反式失活；

D转基因位置效应引起的转基因沉默；

E染色体包装对转基因沉默的影响；

F后成修饰作用导致转基因沉默。第17页,共25页，星期六，2024年，5月（3）转录后水平的转基因沉默A生化开关模型；B异常RNA模型；C反义RNA模型；DRNA介导的病毒抗性模型；（4）从头甲基化与沉默机制

A植物对外源DNA的基因免疫诱导反应；

BDNA-DNA配对诱导；

CDNA-DNA互作诱导。第18页,共25页，星期六，2024年，5月4.克服转基因沉默的策略

(1)转基因的选择：（2）启动子的选择；（3）利用组织和发育特异性作用的增强子（4）利用MAR序列；（5）利用位置特异性重组系统；（6）选择单拷贝的转化体。第19页,共25页，星期六，2024年，5月三、转基因植物中外源基因的遗传特性

通过转基因技术导入受体细胞的外源基因（transgene）进入受体细胞后，其整合、表达和传递规律通常利用表性传递、标记基因及分子杂交分析等方法进行研究。1.外源基因在转化植物中的遗传传递规律（1）孟德尔式分离:1984年David报道，发根农杆菌介导的胡萝卜、烟草和牵牛花转基因植株表型分析和Southern杂交证明，后代中显性位点的遗传为真实的孟德尔式遗传。

第20页,共25页，星期六，2024年，5月单位点插入外源基因：大多数转化植株中，转基因呈单基因显性的孟德尔式分离。转基因有可能作为一个单个显性基因在转基因植株中遗传，相对于转基因来说，植物同源染色体中没有其相对的等位基因位点，因此转基因一般呈显性遗传。单位点插入无论是单拷贝还是多拷贝串联，在不超过一定长度时，大多数转基因植株中外源基因能够稳定遗传并显示孟德尔单基因分离规律。

B.多位点插入外源基因：

Akama等（1992）在拟南芥中发现R1代植株中有10株抗性分离比为3R:1S，3株为15R：1S，1个株系为63R：1S。表明多数情况下外源基因为单位点插入，但也存在二、三个位点插入。进一步对124个转化株进行分子杂交，分析T-DNA的拷贝数，拷贝数为1、2、3个T-DNA者分别为44%、28%和10%，即90%插入拷贝数在4个一下，也有10个拷贝的个体。在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形致死突变。多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点，那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。第21页,共25页，星期六，2024年，5月（2）非孟德尔遗传现象：转基因植株后代分离中，普遍存在显性个体明显不符合孟德尔比例的现象，成为非孟德尔遗传现象。后代显性个体比例明显低于3：1，此外在自交二代中，由于转基因的失活、纯合致死等未知原因而未出现纯合体。转基因丢失：如小麦转化株系中，自交一代能表达，自交二代仅能检测到，自交三代中发生了丢失。B.转基因沉默：转化体仍保留完好的转基因但不表达或表达活性低，或发生重排而不表达，导致后代分离规律的异常。C.转基因逃逸：采用酶活性检测得到的3：1的分离中，部分转化体中仅有20%含目标基因片段，因此需采用标记选择、表达分析及分子检测相结合的方法检测转话体。D.花粉致死：当以转化体为父本与非转化体回交时，只产生非转化体，而非1：1的分离，其原因可能是花粉致死。