鞋类和鞋类部件 抗真菌性能定量评估试验方法

ICS61.060

CCSY78

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXXX–XXXX/ISO20150:2019

鞋类和鞋类部件抗真菌性能定量评估试验

方法

Footwearandfootwearcomponents—Quantitativechallengetestmethodtoassess

antifungalactivity

（ISO20150:2019，IDT）

（征求意见稿）

本稿完成日期：2023-07-06

××××-××-××发布××××-××-××实施

国家市场监督管理总局

国家标准化管理委员会发布

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

鞋类和鞋类部件抗真菌性能定量评估试验方法

警告：本试验方法需要使用微生物真菌。只有经过微生物学培训且具有实践经验的专业人员在具备

处理微生物技术条件的实验室才可使用本文件中的微生物检验方法。

1范围

本文件规定了鞋类及鞋类部件的抗真菌性能的定量评估试验方法。

本文件适用于声明具有抗真菌性能或抗菌性能的鞋类和鞋类部件。

试验可以采用两种方法。方法的选择取决于材料的特性和试验菌种。振荡法适用于所有类型的材料。

对于单一吸水性材料，建议采用吸收法。11.2和11.3中给出了每种方法的简要描述。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

ISO7218食品和动物饲料的微生物学微生物检验一般要求和指南（Microbiologyoffoodand

animalfeedingstuffs—Generalrequirementsandguidanceformicrobiologicalexaminations）

ISO19952鞋类术语（Footwear—Vocabulary）

3术语和定义

ISO19952界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

抗真菌性能antifungalactivity/antimycoticactivity

材料或产品具有阻止或减缓微生物真菌生长、减少微生物真菌数量或杀灭微生物真菌的功效。

3.2

对照样controlspecimen

与试验材料相同但未经抗真菌处理的材料。

注：如无可用的对照样，可使用灭菌的锥形瓶作为对照样。

3.3

中和剂neutralizer

用于灭活、中和或抑制抗真菌剂的抗真菌性能的化学试剂。

[来源：ISO20743:2013，3.7，修改—“抗真菌”代替“抗细菌”。]

4原理

1

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

将规定或要求测试的真菌菌株的孢子悬浮液接种到测试样和对照试样上。有两种测试方法来评估抗

真菌活性。

抗真菌性能是通过计数微生物真菌的数量以及计算抗真菌率来定量测定的。

5安全性

微生物的处理具有潜在的危险，需要高度专业的技术能力并受到当前法律和法规的约束。只有经过

微生物技能培训的人员才能进行这样的测试。

注：请参阅国家特定的有关个人卫生、消毒和灭菌实施规程。

建议执行测试的人员宜参考IEC60068-2-10:2005中附录A和ISO7218。

6仪器设备

6.1总则

可选用适当规格的一次性仪器设备代替重复使用的玻璃器皿和塑料器皿。

常用微生物实验室设备应符合ISO7218，尤其是以下设备。

6.2生物安全柜

6.3培养箱，可保持温度在（28±2）oC。

6.4高压灭菌器，可保持温度在（121±2）oC，压力为（103±5）kPa，用于湿式灭菌。

6.5恒温恒湿试验箱，可保持温度在（28±2）oC，并且相对湿度为（85±5）%。

6.6紫外线灯。

6.7广口瓶，具塞，100mL，适用于高压灭菌器中（6.4）。

6.8旋涡混合器。

6.9离心机，2000g。

6.10振动器，二维或三维，可调整至50r/min。

6.11振荡培养箱，可保持温度在（28±2）oC，振荡频率为（120±10）r/min。

6.12玻璃珠，直径为2mm～3mm，每个锥形瓶10～15个珠，用于制备真菌孢子溶液。

6.13玻璃棉或医用纱布（双层），用于制备真菌孢子溶液。

6.14烘箱，用于干式杀菌。

6.15pH计，精度为0.2。

6.16天平，精度为0.01g。

6.17分光光度计，可测量500nm～660nm波长，或麦克法兰浊度计。

6.18培养皿，已消毒，由玻璃或塑料制成，直径为90mm～100mm或55mm～60mm。

6.19移液管，具有最适合每次使用的容量。

7试剂和培养基

7.1总则

为保证培养基质量，应现配现用。

注：根据ISO11133或根据国家标准或规定进行操作。

试验用试剂应是分析级或适用于微生物的需要。

2

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

7.2水

试验中用于微生物培养基制备的水应是新蒸馏的和/或离子交换的和/或超滤的和/或反渗透过滤的

分析纯水。

水中不应含任何有毒或抑制微生物的物质。

7.3麦芽培养基

7.3.1构成

麦芽提取物30.0g

大豆蛋白胨3.0g

水1000mL

7.3.2配制

将特定成分量的物质溶解于去离子水中，在室温下搅拌并调整pH为（5.5±0.2），在高压灭菌器

（6.4）中（121±2）℃下用饱和水蒸气灭菌15min。

7.4麦芽汁培养基（MEA)

7.4.1构成

麦芽提取物30.0g

大豆蛋白胨3.0g

琼脂15.0g

水1000mL

7.4.2配制

混合后，在室温下搅拌并调节pH值为（5.5±0.2）。在热板上或水浴锅中加热搅拌直到组分完全溶

解，在高压灭菌器（6.4）中（121±2）℃下用饱和水蒸气灭菌15min。冷却并摇匀溶液，然后倒入培

养皿中。

注：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）也可以为微生物真菌生长提供一个完全的培养基。标准的PDA培养基商品有售，

从而避免在制备过程中因马铃薯种类不同而产生的成分差异。使用购买的具有标准组分的PDA培养

基，可以避免马铃薯成分的差异以及在煮沸马铃薯的操作中产生的差异性影响，并且麦芽汁琼脂培养基MEA也

可以通过商业途径获得。

7.5生理盐水（氯化钠溶液）

7.5.1构成

氯化钠，NaCl8.5g

水1000mL

7.5.2配制

混合均匀后，在室温下调节pH值为（6.9±0.2），并在（121±2）℃下灭菌15min。

7.6湿润剂（非离子型表面活性剂）

湿润剂用于收集孢子，不与其他试剂反应并且不会引起微生物真菌数量的减少或增加，例如聚山梨

3

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

醇酯80（TWEEN80），N-甲基牛磺酸，曲拉通-100（TritonTMX-100）1，或聚乙二醇醚等。

注：湿润剂（非离子型表面活性剂）可在试样有涂层时使用。

7.7缓冲液

7.7.1储备液

磷酸二氢钾，KH2PO434.0g

水1000mL

7.7.2配制储备液

称取34.0g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，加入500mL水混合并将其溶解。在室温下用氢氧化

钠将pH值调节为7.2±0.2，继续加去离子水定容至1000mL。

7.7.3配制缓冲液

移取1mL储备液并称取润湿剂（非离子型表面活性剂）（7.6）0.08g，加入去离子水稀释至800mL，

配制成浓度为0.01%缓冲液。充分混合后在（121±2）℃下灭菌15min。

注：如果不需要润湿剂（非离子型表面活性剂），可以省略。

8试验微生物

所使用的菌株应在试验报告中注明。

表1列出了抗真菌性能试验中使用的菌种。

表1试验菌株

微生物真菌a名称WDCM编号CGMCC编号ATCC○R编号

酵母菌白色念珠菌00054AS1.2031ATCC○R10231TMb

黑曲霉00144AS3.4463ATCC○R6275TMb

丝状真菌/霉菌

巴西曲霉00053AS3.5487ATCC○R16404TMb

丝状真菌/癣菌须毛癣菌00191—ATCC○R9533TMb

说明：

WDCM：世界微生物数据中心

CGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心

ATCC：美国菌种保藏中心

注1：WDCM网址：.

注2：其它微生物真菌（合适的菌种或其他合适的菌株）在适当验证后可以使用。

a试验菌株应从世界菌种保藏联合会（WFCC）的机构获得。微生物真菌菌种及其供应来源应在试验报告中注明。

bATCC○R10231TM，ATCC○R6275TM，ATCC○R16404TM，ATCC9533○RTM是商用的合适产品的例子。此信息是为方便本文

件用户而提供的，并不构成ISO对这些产品的宣传。

所有样品都应测试酵母菌（白色念珠菌）。

如果样品声明抗霉菌，还应测试一种霉菌。

1)TritonTMX-100是SIGMA-ALDRICH产品的商品名。此信息是为方便本文件的用户而提供的，并不构成ISO对所

命名产品的宣传。如果可以证明等效产品可以产生相同的结果，则可以使用等效产品。

4

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

如果样品声明抗癣菌，还应测试须毛癣菌。

其他合适的物种或菌株可以使用。

菌株的保存见供应商的说明或EN12353。

9制备试验接种液

9.1菌株代数

使用4代内的菌株。

9.2白色念珠菌接种液的制备

9.2.1使用无菌接种环，将一个白色念珠菌落转移至20mL的麦芽培养基（7.3）中，并放在恒温振荡

箱中，在（28±2）℃中培养16h～20h（隔夜培养），或放在标准PDA培养基上，在（28±2）℃培养

24h～48h。

9.2.2制备不含润湿剂（非离子表面活性剂）（7.6）的新鲜缓冲液（7.7），用于制备菌悬液。采用平板

计数法或分光光度计或其他合适的方法估算菌悬液中的酵母菌的数量，以酵母菌浓度在1.0×105

CFU/mL～5.0×105CFU/mL之间的菌悬液作为试验接种液。

如有必要，试验的接种液可在室温储存并在2h内使用。

9.3丝状真菌孢子悬浮液的制备

9.3.1将微生物真菌孢子接种到MEA培养基（7.4）（或PDA培养基）表面，在（28±2）℃培养，直到

培养基表面长满微生物真菌孢子（曲霉类：约1周～2周，毛癣菌类：约2周～3周）。

9.3.2在每个培养管或培养皿中加入5mL生理盐水（7.5）。可加入无菌的润湿剂（非离子表面活性剂）

（7.6）至最终浓度为0.01%。用无菌接种环轻轻刮培养基表面的孢子，使孢子分散在液体中。轻轻摇

动培养管或培养皿，使孢子充分分散在液体中。将洗出的孢子转移至含有无菌玻璃珠的无菌锥形瓶中。

在相同的培养管或培养皿重复此步骤两次。摇动锥形瓶，以获得充分均匀的孢子悬浮液。每个真菌培养

基的孢子悬浮液通过双层医用纱布或玻璃棉至少过滤两次，以除去菌丝碎片、琼脂块，并分离孢子团。

在无菌条件下，滤出的孢子悬浮液在2000g的离心力下离心1min，弃去上清液。将沉淀物重新

悬浮于20mL生理盐水（7.5）中，并再次离心。用上述方法重复洗涤孢子至少三次，用缓冲液（7.7）

稀释孢子悬浮液，用计数板计数，将孢子浓度调至1.0×106个孢子/mL～5.0×106个孢子/mL。也可采用

其他适当的计数方法测定孢子含量。使用新鲜的孢子悬浮液，或储存在2℃～8℃冰箱3d内制备的。

注：由于丝状真菌的孢子回收率可能较低，需配制较高浓度的孢子接种液。

10制备试样

10.1总则

仅测试声明具有抗真菌性能的部件或材料。如果声明整鞋是抗真菌的，其主要部件包括帮面、衬里、

内底、内垫、外底应分别进行测试。

若声明只有部件的一种材料是抗真菌的，如可能应分开进行测试。否则，应测试整个部件。

每个测试样品应至少为部件或材料表面积的80%。如果单一材料面积不足80%，应取部件中两种

主要的材料。

试验样品也可以选择直接从鞋类原材料中得到。

5

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

10.2试样

试样的面积约500mm2，厚度小于5.0mm。保持试样的完整性，不应将其剪碎。试样的面积和重量

应记录在试验报告中。如使用了较大的试样，真菌悬浮液体积量按比例增加。

如果试样的厚度不可能降低（例如：不改变材料关键性质条件下的厚部件不能分离或切割，如表面

形态可能影响真菌与表面的作用），厚度应记录在试验报告中。

对于每一种材料或部件和每一菌种，至少取6个试样。

10.3试样的预处理

试样的预处理是可选择的，并且只在试样受到高的生物负载（污染等）时使用。

如果对试样使用了灭菌法，报告中应详细记录，并且不应影响抗真菌性能或者材料本身。

注：测试样和对照样可以通过高压灭菌器（6.4），在（121±2）℃和103kPa下灭菌15min，或通过紫外线照射

（紫外线灯30W，放置在距离样品300mm处，每侧各照射1h）或者其他适用的灭菌方法灭菌。

11试验步骤

11.1测试方法综述

表2中列出了每种测试方法的应用条件。测试方法的选择取决于材料的性质和试验菌种。

表2测试方法列表

振荡法吸收法b

方法

（11.2）（11.3）

材料类型a吸水材料和非吸水材料或组合材料吸水材料c

微生物真菌酵母菌和丝状真菌酵母菌和丝状真菌

a对于吸水材料，非吸水材料和组合材料的分类，参照ISO16187。

b对于单一的吸水材料，首选吸收法测试。

C不包含不能被完全洗脱的材料。

11.2振荡法

11.2.1接种

将6个测试样（3个为培养时间0h，3个为培养时间24h）和6个对照试样（3个为培养时间0h，

3个为培养时间24h）分别单独放置在250mL的灭菌锥形瓶中。

移取9.2或9.3中制备的接种液（50±0.5）mL接种到每个测试样和对照样。

如果没有对照样可用，将无菌锥形瓶作为对照样接种来确定测试有效性。

11.2.2接种后中和洗脱（时间为0h）

接种后，盖紧瓶盖，使用漩涡混合器1min×5圈，或用手以约30cm幅度振荡1min×5圈。然后

将时间为0h的测试样和对照样立即中和。

从3个测试样和对照样中分别移取0.2mL并加入装有19.8mL生理盐水（7.5）的试管中，以约

30cm幅度振荡30s，或使用漩涡混合器（6.8）5s×5圈，以洗脱出真菌。

可使用其他合适的中和剂（见EN1275:2005附录B）并应记录在试验报告中。

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GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

11.2.3接种

把其他3个接种测试样和3个接种对照样置于振荡培养箱（6.11）内以120r/min频率在温度为（28

±2）℃下培养（24±2）h。

11.2.4培养后中和洗脱（时间为24h）

3个测试样和3个对照样（如可用）培养24h后，按照11.2.2的步骤进行中和、洗脱。

11.2.5微生物真菌数量的测定

用无菌移液管从11.2.2或11.2.4移取（1.0±0.1）mL洗脱液，并将其加到有（9.0±0.1）mL

生理盐水（7.5）的试管中，充分摇匀。用生理盐水（7.5）稀释洗脱液，制得10倍系列稀释溶液。

用无菌移液管移取每种稀释液100μL接种到MEA培养基（7.3）或PDA培养基上，平行双份，将

琼脂平板倒置，在（28±2）℃下培养白色念珠菌48h，培养曲霉菌类3d～7d，培养须毛癣菌1周～

2周。

培养后，计数菌落数量在8～300内的培养皿中的菌落数量。如果菌落数量小于8，计数并记录此

菌落数。如果没有找到菌落，记录菌落数量为<1。如果菌落数量与连续稀释倍数不成梯度变化，记录并

计算在较大稀溶液中的结果。

11.3吸收法

11.3.1接种

6个测试样（3个为培养时间0h，3个为培养时间24h）和6个对照样（3个为培养时间0h，3

个为培养时间24h）分别单独放置在无菌的广口瓶中。

移取9.2或9.3中制备的接种液（1.0±0.1）mL加入到每个测试样和对照样上，并拧紧螺旋盖。

注：因接种液体积与试样有很大关系，可以调整体积从1mL减少至100μL，以保证接种液和试样的充分接触和避

免扩散到瓶中。

如果没有对照样可用，将接种的没有样品的无菌锥形瓶作为对照样，确定抗菌有效性。

11.3.2接种后中和洗脱（时间为0h）

接种后，应立即对3个测试样和3个对照样进行中和洗脱。

在接种的3个测试样和3个对照样中分别加入100mL生理盐水（7.5）。

拧紧盖子，以约30cm幅度手持振荡30s，或者用涡旋混合器（6.8）混合5s×5圈，以洗脱出

真菌。

11.3.3培养

将另外接种过的3个测试样和3个对照样放置在（28±2）oC下培养（24±2）h。

11.3.4培养后中和洗脱（时间为24h）

培养24h后，按照11.3.2的步骤进行中和、洗脱。

11.3.5微生物真菌数量的测定

按照11.2.5确定每个试样中的微生物真菌的数量。

12结果表达

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GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

12.1计算微生物真菌的数量

对于每个试样，通过公式（1）确定微生物真菌的数量：

M=Z×B×100.................................................（1）

式中：

M——每个试样中微生物真菌的数量，单位为菌落数每毫升（CFU/mL）；

Z——两组培养皿中微生物真菌菌落的平均数量；

B——稀释的比率；

100——中和稀释的比率。

12.2测试有效性的判定

a）接种和培养后3个对照试样的极差值分别应为△（lgC）≤1，C是通过12.1得出的对照样的

微生物真菌的数量。

b）接种后对照试样的菌落平均数量的最小值应不小于1×105CFU，且与接种液相比，培养后不得

减少超过一个数量级。

c）根据平板计数法，通过公式（2）计算生长值（F），对于酵母菌应满足F≥0，对于丝状微真菌

（癣菌和霉菌），应满足F≥-1。

F=lgCt－lgC0.................................................（2）

式中：

F——对照样微生物真菌的生长值；

Ct——培养后3个对照样菌落的平均数量，单位为菌落数每毫升（CFU/mL）；

C0——接种后3个对照样菌落的平均数量，单位为菌落数每毫升（CFU/mL）。

当上述条件a）、b）和c）都满足时，可认为该测试是有效的。如果有一个条件不符合，则认为该

测试是无效的，样品应重新测试。

12.3抗真菌率的计算

对于鞋类和鞋类部件中每种材料或部件的抗真菌率应单独记录。

用公式（3）计算抗真菌率（R），或用公式（4）计算R*。记录结果用百分数表示，保留三个有效

数字。

CT

Rtt100%.................................................（3）

Ct

式中：

Ct——在24h或规定的培养期后3个对照样菌落的平均数量，单位为菌落数每毫升（CFU/mL）；

Tt——在24h或规定的培养期后3个测试样菌落的平均数量，单位为菌落数每毫升（CFU/mL）。

在没有对照样可用的情况下，用公式（4）中的T0代替公式（3）中的Ct计算R*。

TT

R*0t100%...............................................（4）

T0

式中：

T0——接种后3个测试试样菌落的平均数量，单位菌落数每毫升（CFU/mL）。

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13试验报告

试验报告应至少包括以下信息：

a）本文件编号；

b）测试部件的所有必要信息，例如位置、面积、重量等；

c）测试样品的培养条件（例如温度、时间）；

d）用于不同材料抗真菌性能测定的试验方法（例如振荡法或吸收法）；

e）试样制备，如有，包括对于不同样品的预处理方法（例如灭菌方法）；

f）对于不同材料上试验真菌的菌种、编号和数量；

g）添加到接种液中的润湿剂（非离子表面活性剂）及其浓度；

h）测试有效性的判定；

i）不同材料或部件的抗真菌率；

j）与本方法的任何偏差。

9

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

参考文献

[1]ISO11133Microbiologyoffoodandanimalfeedandwater—Preparation,production,

storageandperformancetestingofculturemedia

[2]ISO16187Footwearandfootwearcomponents—Testmethodtoassessantibacterial

activity

[3]ISO20743:2013Textiles—Determinationofantibacterialactivityoftextile

products

[4]EN1275:2005Chemicaldisinfectantsandantiseptics—Quantitativesuspensiontest

fortheevaluationofbasicfungicidalorbasicyeasticidalactivityofchemical

disinfectantsandantiseptics—Testmethodandrequirements(phase1)

[5]EN12353Chemicaldisinfectantsandantiseptics—Preservationoftestorganismsused

forthedeterminationofbactericidal(includingLegionella),mycobactericidal,

sporicidal,fungicidalandvirucidal(includingbacteriophages)activity

[6]IEC60068-2-10:2005,Environmentaltesting—Part2-10:Tests—TestJandguidance:

Mouldgrowth

_________________________________

1

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

本文件等同采用ISO20150:2019《鞋类和鞋类部件抗真菌性能定量评估试验方法》。

本文件由中国轻工业联合会提出。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国制鞋标准化技术委员会(SAC/TC305)归口。

本文件起草单位：

本文件主要起草人：

I

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鞋类和鞋类部件抗真菌性能定量评估试验方法

警告：本试验方法需要使用微生物真菌。只有经过微生物学培训且具有实践经验的专业人员在具备

处理微生物技术条件的实验室才可使用本文件中的微生物检验方法。

1范围

本文件规定了鞋类及鞋类部件的抗真菌性能的定量评估试验方法。

本文件适用于声明具有抗真菌性能或抗菌性能的鞋类和鞋类部件。

试验可以采用两种方法。方法的选择取决于材料的特性和试验菌种。振荡法适用于所有类型的材料。

对于单一吸水性材料，建议采用吸收法。11.2和11.3中给出了每种方法的简要描述。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

ISO7218食品和动物饲料的微生物学微生物检验一般要求和指南（Microbiologyoffoodand

animalfeedingstuffs—Generalrequirementsandguidanceformicrobiologicalexaminations）

ISO19952鞋类术语（Footwear—Vocabulary）

3术语和定义

ISO19952界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

抗真菌性能antifungalactivity/antimycoticactivity

材料或产品具有阻止或减缓微生物真菌生长、减少微生物真菌数量或杀灭微生物真菌的功效。

3.2

对照样controlspecimen

与试验材料相同但未经抗真菌处理的材料。

注：如无可用的对照样，可使用灭菌的锥形瓶作为对照样。

3.3

中和剂neutralizer

用于灭活、中和或抑制抗真菌剂的抗真菌性能的化学试剂。

[来源：ISO20743:2013，3.7，修改—“抗真菌”代替“抗细菌”。]

4原理

1

GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

将规定或要求测试的真菌菌株的孢子悬浮液接种到测试样和对照试样上。有两种测试方法来评估抗

真菌活性。

抗真菌性能是通过计数微生物真菌的数量以及计算抗真菌率来定量测定的。

5安全性

微生物的处理具有潜在的危险，需要高度专业的技术能力并受到当前法律和法规的约束。只有经过

微生物技能培训的人员才能进行这样的测试。

注：请参阅国家特定的有关个人卫生、消毒和灭菌实施规程。

建议执行测试的人员宜参考IEC60068-2-10:2005中附录A和ISO7218。

6仪器设备

6.1总则

可选用适当规格的一次性仪器设备代替重复使用的玻璃器皿和塑料器皿。

常用微生物实验室设备应符合ISO7218，尤其是以下设备。

6.2生物安全柜

6.3培养箱，可保持温度在（28±2）oC。

6.4高压灭菌器，可保持温度在（121±2）oC，压力为（103±5）kPa，用于湿式灭菌。

6.5恒温恒湿试验箱，可保持温度在（28±2）oC，并且相对湿度为（85±5）%。

6.6紫外线灯。

6.7广口瓶，具塞，100mL，适用于高压灭菌器中（6.4）。

6.8旋涡混合器。

6.9离心机，2000g。

6.10振动器，二维或三维，可调整至50r/min。

6.11振荡培养箱，可保持温度在（28±2）oC，振荡频率为（120±10）r/min。

6.12玻璃珠，直径为2mm～3mm，每个锥形瓶10～15个珠，用于制备真菌孢子溶液。

6.13玻璃棉或医用纱布（双层），用于制备真菌孢子溶液。

6.14烘箱，用于干式杀菌。

6.15pH计，精度为0.2。

6.16天平，精度为0.01g。

6.17分光光度计，可测量500nm～660nm波长，或麦克法兰浊度计。

6.18培养皿，已消毒，由玻璃或塑料制成，直径为90mm～100mm或55mm～60mm。

6.19移液管，具有最适合每次使用的容量。

7试剂和培养基

7.1总则

为保证培养基质量，应现配现用。

注：根据ISO11133或根据国家标准或规定进行操作。

试验用试剂应是分析级或适用于微生物的需要。

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7.2水

试验中用于微生物培养基制备的水应是新蒸馏的和/或离子交换的和/或超滤的和/或反渗透过滤的

分析纯水。

水中不应含任何有毒或抑制微生物的物质。

7.3麦芽培养基

7.3.1构成

麦芽提取物30.0g

大豆蛋白胨3.0g

水1000mL

7.3.2配制

将特定成分量的物质溶解于去离子水中，在室温下搅拌并调整pH为（5.5±0.2），在高压灭菌器

（6.4）中（121±2）℃下用饱和水蒸气灭菌15min。

7.4麦芽汁培养基（MEA)

7.4.1构成

麦芽提取物30.0g

大豆蛋白胨3.0g

琼脂15.0g

水1000mL

7.4.2配制

混合后，在室温下搅拌并调节pH值为（5.5±0.2）。在热板上或水浴锅中加热搅拌直到组分完全溶

解，在高压灭菌器（6.4）中（121±2）℃下用饱和水蒸气灭菌15min。冷却并摇匀溶液，然后倒入培

养皿中。

注：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）也可以为微生物真菌生长提供一个完全的培养基。标准的PDA培养基商品有售，

从而避免在制备过程中因马铃薯种类不同而产生的成分差异。使用购买的具有标准组分的PDA培养

基，可以避免马铃薯成分的差异以及在煮沸马铃薯的操作中产生的差异性影响，并且麦芽汁琼脂培养基MEA也

可以通过商业途径获得。

7.5生理盐水（氯化钠溶液）

7.5.1构成

氯化钠，NaCl8.5g

水1000mL

7.5.2配制

混合均匀后，在室温下调节pH值为（6.9±0.2），并在（121±2）℃下灭菌15min。

7.6湿润剂（非离子型表面活性剂）

湿润剂用于收集孢子，不与其他试剂反应并且不会引起微生物真菌数量的减少或增加，例如聚山梨

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GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

醇酯80（TWEEN80），N-甲基牛磺酸，曲拉通-100（TritonTMX-100）1，或聚乙二醇醚等。

注：湿润剂（非离子型表面活性剂）可在试样有涂层时使用。

7.7缓冲液

7.7.1储备液

磷酸二氢钾，KH2PO434.0g

水1000mL

7.7.2配制储备液

称取34.0g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，加入500mL水混合并将其溶解。在室温下用氢氧化

钠将pH值调节为7.2±0.2，继续加去离子水定容至1000mL。

7.7.3配制缓冲液

移取1mL储备液并称取润湿剂（非离子型表面活性剂）（7.6）0.08g，加入去离子水稀释至800mL，

配制成浓度为0.01%缓冲液。充分混合后在（121±2）℃下灭菌15min。

注：如果不需要润湿剂（非离子型表面活性剂），可以省略。

8试验微生物

所使用的菌株应在试验报告中注明。

表1列出了抗真菌性能试验中使用的菌种。

表1试验菌株

微生物真菌a名称WDCM编号CGMCC编号ATCC○R编号

酵母菌白色念珠菌00054AS1.2031ATCC○R10231TMb

黑曲霉00144AS3.4463ATCC○R6275TMb

丝状真菌/霉菌

巴西曲霉00053AS3.5487ATCC○R16404TMb

丝状真菌/癣菌须毛癣菌00191—ATCC○R9533TMb

说明：

WDCM：世界微生物数据中心

CGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心

ATCC：美国菌种保藏中心

注1：WDCM网址：.

注2：其它微生物真菌（合适的菌种或其他合适的菌株）在适当验证后可以使用。

a试验菌株应从世界菌种保藏联合会（WFCC）的机构获得。微生物真菌菌种及其供应来源应在试验报告中注明。

bATCC○R10231TM，ATCC○R6275TM，ATCC○R16404TM，ATCC9533○RTM是商用的合适产品的例子。此信息是为方便本文

件用户而提供的，并不构成ISO对这些产品的宣传。

所有样品都应测试酵母菌（白色念珠菌）。

如果样品声明抗霉菌，还应测试一种霉菌。

1)TritonTMX-100是SIGMA-ALDRICH产品的商品名。此信息是为方便本文件的用户而提供的，并不构成ISO对所

命名产品的宣传。如果可以证明等效产品可以产生相同的结果，则可以使用等效产品。

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GB/TXXXXX—××××/ISO20150:2019

如果样品声明抗癣菌，还应测试须毛癣菌。

其他合适的物种或菌株可以使用。

菌株的保存见供应商的说明或EN12353。

9制备试验接种液

9.1菌株代数

使用4代内的菌株。

9.2白色念珠菌接种液的制备

9.2.1使用无菌接种环，将一个白色念珠菌落转移至20mL的麦芽培养基（7.3）中，并放在恒温振荡

箱中，在（28±2）℃中培养16h～20h（隔夜培养），或放在标准PDA培养基上，在（28±2）℃培养

24h～48h。

9.2.2制备不含润湿剂（非离子表面活性剂）（7.6）的新鲜缓冲液（7.7），用于制备菌悬液。采用平板

计数法或分光光度计或其他合适的方法估算菌悬液中的酵母菌的数量，以酵母菌浓度在1.0×105

CFU/mL～5.0×105CFU/mL之间的菌悬液作为试验接种液。

如有必要，试验的接种液可在室温储存并在2h内使用。

9.3丝状真菌孢子悬浮液的制备

9.3.1将微生物真菌孢子接种到MEA培养基（7.4）（或PDA培养基）表面，在（28±2）℃培养，直到

培养基表面长满微生物真菌孢子（曲霉类：约1周～2周，毛癣菌类：约2周～3周）。

9.3.2在每个培养管或培养皿中加入5mL生理盐水（7.5）。可加入无菌的润湿剂（非离子表面活性剂）

（7.6）至最终浓度为0.01%。用无菌接种环轻轻刮培养基表面的孢子，使孢子分散在液体中。轻轻摇

动培养管或培养皿，使孢子充分分散在液体中。将洗出的孢子转移至含有无菌玻璃珠的无菌锥形瓶中。

在相同的培养管或培养皿重复此步骤两次。摇动锥形瓶，以获得充分均匀的孢子悬浮液。每个真菌培